Aula 5 - Cinética Enzimática

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QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013
Cine´tica enzima´tica
Guilherme Menegon Arantes
Instituto de Quı´mica
Universidade de Sa˜o Paulo
garantes@iq.usp.br http://gaznevada.iq.usp.br
Universidade de Sa˜o Paulo
QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013
Resumo da aula
• Enzimas sa˜o catalisadores biolo´gicos
• Equac¸a˜o de Michaelis-Mentem:
– Derivac¸a˜o
– Variac¸o˜es
– Interpretac¸o˜es e medidas experimentais
• Eficieˆncia e modulac¸a˜o da atividade enzima´tica
• Tipos de inibic¸a˜o e suas respectivas equac¸o˜es
Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica
QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013
Enzimas sa˜o catalisadores biolo´gicos
• Condic¸o˜es para um organismo vivo: auto-reproduzir e
catalisar reac¸o˜es eficiente e seletivamente
• Proteı´nas (ou ribozimas). Contem co-fatores, metais, etc.
• Classificadas segundo a reac¸a˜o catalisada:
oxidoredutases, hidrolases, ligases, isomerases, ...
• Acelerac¸o˜es enzima´ticas por fatores de 105 a 1020
• Forma-se complexo enzima-substrato (E·S, Michaelis)
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Equac¸a˜o de Michaelis-Mentem
E + S
k1
⇀↽
k
−1
E · S
kcat
−→ E + P
KS =
[E][S]
[E · S]
=
k−1
k1
KM =
k−1 + kcat
k1
• Vamos deduzir a equac¸a˜o abaixo
• Na maioria das enzimas k−1 ≫ kcat ⇔ KM ≃ KS
• Como a velocidade inicial de formac¸a˜o do produto e´
V0 = kcat [E·S], a velocidade ma´xima e´ Vmax = kcat [ET], e
[E]T = [E] + [E·S], temos:
V0 =
kcat[E]T[S]
KM + [S]
=
Vmax[S]
KM + [S]
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Interpretando e visualisando os termos
• [S], V0, Vmax e KM podem ser medidos facilmente
• Invertemos os dois lados→ Eq. Lineweaver-Burk:
1
V0
=
KM
Vmax[S]
+
1
Vmax
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Eficieˆncia e modulac¸a˜o da atividade enzima´tica
• Proteı´nas fosfatases (PTP) e oritidina decarboxilase sa˜o
ainda mais eficientes, com acelerac¸o˜es de ∼ 1020!
• Enzimas sa˜o reguladas por modificac¸o˜es covalentes
reversı´veis, principalmente fosforilac¸a˜o em Ser, Thr e Tyr
• Pequenas mole´culas efetoras (comportamento aloste´rico)
e inibidores tambe´m modulam atividade
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Inibidores competitivos
• Vmax → Vmax e KM → αKM (K
app
M )
1
V0
=
αKM
Vmax[S]
+
1
Vmax
Ki =
KM [I ]
KappM −KM
=
KM [I ]
KM (α− 1)
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Inibidores na˜o-competitivos
• Vmax → Vmax/α
′(V appmax) e KM → KM/α
′
1
V0
=
KM
Vmax[S]
+
α′
Vmax
Ki =
V appmax[I ]
Vmax
=
1
α
−
1
Vmax
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Inibidores mistos
• Vmax → Vmax/α
′ e KM → αKM/α′
1
V0
=
αKM
Vmax[S]
+
α′
Vmax
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[P]
tempo
[P]
tempo
V = ∆[P]/∆t
Qual v usar?
inclinação = ∆y/∆x
v = k [E] [S]
Assim, se [S] ~ constante (igual à inicial), a velocidade é
diretamente proporcional a concentração de enzima
[P]
tempo
Se menos de 5%
for consumido,
podemos assumir
v ~ constante.
(v inicial).
Medida de velocidade inicial
Construir uma curva de [P] x tempo e verificar se é linear.
[P]
tempo
[P]
tempo
vários tempos x 1 único tempo
[P]
tempo
- “esgotamento” do substrato
- inativação da enzima
v = k [E] [S]
Porque conhecer Ks?
-comparar enzimas de diferentes fontes (tecidos, organismos, fase
do ciclo de vida, etc...).
-comparar diferentes substratos de uma mesma enzima (relação
com afinidade)
Porque conhecer Vmax?
Para uma mesma preparação enzimática é possível comparar a
velocidade de catálise para diferentes tipos de substrato (Vmax
k3).
Porque conhecer Vmax/Ks?
Eficiência de catálise de diferentes substratos
Caracterização da alfa-glicosidase: Km e Vmax 
 
Objetivos 
Caracterizar a α-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae através das determinações da afinidade 
(Km) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol-α-glicosídeo) e da velocidade máxima (Vmax) de hidrólise 
do substrato. 
Procedimento A – Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae 
 
OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
 
UTILIZE A DILUIÇÃO USADA NA PRÁTICA 3. SOMENTE CASO NÃO SEJA POSSÍVEL, 
EMPREGUE O PROCEDIMENTO ABAIXO. NOTE QUE O VOLUME TOTAL NECESSÁRIO SERÁ 
DE 5,0 mL. 
Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces 
cerevisiae. 
 
1. Transferir 0,1 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L10X. 
2. Adicionar 0,9 mL de água destilada gelada. 
3. Homogeneizar SUAVEMENTE. 
4. Transferir 0,5 mL de L10X para um novo tubo identificado com L100X. 
5. Adicionar 4,5 mL de água destilada gelada. 
Homogeneizar SUAVEMENTE. 
Procedimento B – Medidas de velocidade da reação de hidrólise do substrato 
 
OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 1. 
ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato. 
 
2. Preparar os tubos em banho de gelo 
3. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados na 
Tabela 1. Agitar manualmente com cuidado. 
4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC 
5. Incubar todos os tubos por 40 min (OU PELO DOBRO DO MAIOR TEMPO USADO NA PRÁTICA 3). 
6. Remover todos os tubos do banho. 
7. Adicionar 2 mL de tampão carbonato-bicarbonato. 
8. Deixar os tubos em temperatura ambiente. 
9. Homogeneizar em vórtice. 
10. Usar a água para calibrar (zerar) o espectrofotômetro. 
11. Ler as absorbâncias a 420 nm. 
12. Completar a Tabela 2. 
13. Construir os gráficos necessários para a determinação do Km e Vmax da α-glicosidase para o 
substrato utilizado. 
Tabela 1 
tubos 
NPαGlc 
1,0 mM 
(mL) 
NPαGlc 
2,0 mM 
(mL) 
NPαGlc 
8,0 mM 
(mL) 
tampão fosfato 
100 mM pH 7 
(mL) 
lisado 
diluído 
(mL) 
1 0,02 - - 0,28 0,10 
2 0,04 - - 0,26 0,10 
3 0,08 - - 0,22 0,10 
4 0,12 - - 0,18 0,10 
5 0,16 - - 0,14 0,10 
6 0,20 - - 0,10 0,10 
7 - 0,16 - 0,14 0,10 
8 - 0,20 - 0,10 0,10 
9 - - 0,10 0,20 0,10 
10 - - 0,13 0,17 0,10 
11 - - 0,15 0,15 0,10 
 
Tabela 2 
tubos 
[S] 
(no tubo 
de 
ensaio) 
(mM) 
A420 
nmols de 
produto 
Tempo 
da 
reação 
(min) 
Velocidade 
(nmol/min) 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
11