Relatório 3 - Caracterização e cinética enzimática

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
	FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS	
QBQ0316 N - Bioquímica Experimental
RELATÓRIO 03
Déborah F. Rigo, Nº USP 8021252
Pedro H. S. Medeiros N° USP: 5899281
Tarik K. Andrade N° USP 8072472
Grupo 10
São Paulo, 2013
1.0 Introdução:
A enzima que trabalhamos foi a alpha-glucosidase, seu peso molecular é de aproximadamente 45Kda[6.1] e por isso usa-se métodos cromatográficos para separa-la. Em práticas anteriores usamos a cromatografia de troca iônica que se mostrou eficiente na separação, porém agora a separamos por tamanho com gel de poliacrilamida.
O Vmax é a velocidade reacional enzimática quando a concentração de substrato é ótima e o Kmé a metade da concentração ótima de substrato medindo assim a afinidadeda enzima pelo substrato. Tais valores são ambos obtidos pelo gráfico de velocidade (V) por concentração de substrato ([S]).
A maltose atua como um inibidor competitivo em relação à glicose, pois suas estruturas são muito parecidas, ou seja, ela pode se encaixar ao sítio ativo sem que aja posterior reação. Tal padrão de inibição causa um aparente aumento de Km, porém em altas concentrações de substratos a inibição é “rompida” e, portanto o Vmax se mantém.
2.0 Objetivos
– Purificação de proteínas – SDS-PAGE 
– Caracterização da α–glicosidase: Km e Vmax
– Caracterização da α–glicosidase: determinação de padrão de inibição por maltose
3.0 Materiais e Métodos
3.1 Prática 6 etapa A 
Na etapa A fizemos a dialise do DEAE, colocando-o em um eppendorf com o máximo do volume da amostra sem precisarmos completar com água, este foi coberto por um membrana de dialise e colocada e água com agitação constante.
Em seguida as técnicas realizaram a secagem à vácuo e a desnaturação das proteínas da amostra.
3.2 Prática 6 etapa B
	Nessa etapa houve a preparação do gel SDS-PAGE que foi realizado pelas técnicas.
3.3 Prática 6 etapa C
Nessa etapa foi feito a eletroforese, a coloração e a descoloração do gel.
A amostra aplicada no gel foi preparada antes com um corante para que possamos visualizar o fim da eletroforese, em seguida aplicada nos poços do gel. 
Depois do tempo necessário para a corrida o gel foi retirado e colocado em um recipiente com corante para que a coloração ocorresse, e depois foi trocado de recipiente para um com apenas água para que ocorresse a descoloração.
3.4 Prática 6 etapa D
Essa etapa foi realizada pelas técnicas e consistiu na desidratação do gel
3.5 Prática 7 etapa A
Nessa etapa foi feita a diluição do lisado para 10 vezes e 100 vezes.
3.4 Prática 7 etapa B
	Seguindo a tabela 2 do protocolo, 11 tubos foram preparados e deixados em banho de 30°C durante 30 min, após serem retirados do banho foi adicionado tampão bicarbonato para parar a reação e essas amostras foram então colocadas na microplaca para leitura no espectrofotômetro. Com o objetivo de medir a velocidade da reação
3.4 Prática 8 etapa A
	Seguindo a tabela 1, já que somos um grupo par, preparamos 12 tubos que foram levados a banho de 30°C durante 60 min e após serem retirados foi adicionado tampão bicarbonato para parar a reação então essas amostras foram pipetadas na microplaca para a leitura no espectrofotômetro. Com a finalidade de medir o Km.
4.0 Resultados e Discussão
4.1 Prática 6
Ao final da corrida, o gel foi recolhido e o resultado do grupo está representado na figura 1:
	
Figura 1 - Gel obtido após corrida, Grupo 10. PM= Pesos Moleculares; L= Lisado; D= DEAE
	 A provável banda de Alpha-Glicosidase é a mais destacada em azul, que fica mais evidente em (D), graças à maior concentração no material DEAE.
 Analisando a tabela com os padrões de pesos moleculares, o grupo estimou que a proteína pese em torno de 65 a 70 kDa.
 A banda mais forte no material DEAE pode ser explicada pelo processo de purificação pelo qual este material foi submetido, abarcando mais alpha-glicosidase, e portanto, apresentando uma maior resposta no SDS.
	
	
	
4.2 Prática7
	Os Resultados da prática 7 está apresentado na tabela 1 abaixo:
Tabela 1 - Resultados da leitura da prática 7
	ABS420nm
	Tubo 1
	0,064
	0,074
	0,098
	Tubo 2
	0,116
	0,116
	0,093
	Tubo 3
	0,143
	0,151
	0,145
	Tubo 4
	0,19
	0,189
	0,173
	Tubo 5
	0,195
	0,189
	0,189
	Tubo 6
	0,223
	0,219
	0,224
	Tubo 7
	0,25
	0,229
	0,239
	Tubo 8
	0,301
	0,295
	0,289
	Tubo 9
	0,301
	0,302
	0,294
	Tubo 10
	0,325
	0,334
	0,336
	Tubo 11
	0,34
	0,326
	0,3
4.3 Prática 8
Os resultados da prática 8 estão dispostos na tabela 2 abaixo:
Tabela 2 - Resultados da leitura da prática 8
	ABS420nm
	1A/7A
	0,097
	0,092
	0,107
	1B/7B
	0,083
	0,096
	0,081
	2A/8A
	0,13
	0,137
	0,136
	2B/8B
	0,139
	0,16
	0,143
	3A/9A
	0,17
	0,162
	0,17
	3B/9B
	0,17
	0,155
	0,144
	4A/10A
	0,174
	0,173
	0,169
	4B/10B
	0,177
	0,17
	0,157
	5A/11A
	0,234
	0,237
	0,265
	5B/11B
	0,25
	0,257
	0,278
	6A/12A
	0,259
	0,272
	0,276
	6B/12B
	0,29
	0,291
	0,265
Conclusões:
Dentre as técnicas utilizadas a eletroforese foi a escolhida por apresentar baixo índice de erros e boa leitura 
O padrão de inibição esperado para a maltose foi confirmado pelos resultados experimentais e foi possível determiná-lo a partir dos valores de Vmáx e Km.
Contudo, os objetivos foram alcançados e foi possível realizar a caracterização da alpha glicosidase quanto ao peso molecular, velocidade máxima, Km e o padrão de inibição por maltose na catálise da reação de hidrólise do p-nitrofenil glicosídeo.
Referências
Portal de pesquisa da BVS. Disponível em: http://bvsalud.org/portal/resource/pt/mdl-16581150 acesso em novembro de 2013
Resumo anual da SBPC. Disponivel em: http://www.sbpcnet.org.br/livro/62ra/resumos/resumos/2519.htm acesso em novembro de 2013 
Carlos Hotta Lab. Apostila de Exercícios. Disponível em: http://www.carloshotta.com.br/storage/2013_qbq0316n/apostila_protocolos_Bioq_Exp.pdf. Acesso em 13/09/2013
7.0 Anexo: Questões complementares
1. O provável peso molecular da α-glicosidase. Para obter esta informação, será necessário: 
a) Identificar a banda correspondente à α-glicosidase no gel de SDS-PAGE. 
A provável banda correspondente à α-glicosidase é a destacada no gel abaixo. Conclui-se isso pois a mesma está presente nas amostra de lisado e na amostra pós purificação, sendo que, nesta segunda, está mais forte, o que provavelmente ocorre devido ao grau de pureza da mesma após o processo.
b) Calcular o provável peso molecular relativo da enzima através dos padrões utilizados na eletroforese. 
De acordo com o padrão abaixo, o peso molecular indicado para a banda selecionada está entre 65 e 70kDa.
2. O Km e o Vmax da α-glicosidase. Para obter esta informação, será necessário: 
a) Calcular a velocidade inicial (nmol/min) da reação em todos os tubos da P7 
	Tubos
	[S] no tubo de ensaio (mM)
	Réplica 1 (A420)
	Réplica 2 (A420)
	Réplica 3 (A420)
	Média
(A420)
	Produto (nmols)
	Tempo de reação (min)
	Velocidade
(nmols/min)
	1
	0,05
	0,064
	0,074
	0,098
	0,0787
	3,8667
	40
	0,0967
	2
	0,1
	0,116
	0,116
	0,093
	0,1083
	11,283
	40
	0,2821
	3
	0,2
	0,143
	0,151
	0,145
	0,1463
	20,783
	40
	0,5196
	4
	0,3
	0,19
	0,189
	0,173
	0,1840
	30,200
	40
	0,7550
	5
	0,4
	0,195
	0,189
	0,189
	0,1910
	31,950
	40
	0,7988
	6
	0,5
	0,223
	0,219
	0,224
	0,2220
	39,700
	40
	0,9925
	7
	0,8
	0,25
	0,229
	0,239
	0,2393
	44,033
	40
	1,1008
	8
	1,0
	0,301
	0,295
	0,289
	0,2950
	57,950
	40
	1,4488
	9
	2,0
	0,301
	0,302
	0,294
	0,2990
	58,950
	40
	1,4738
	10
	2,6
	0,325
	0,334
	0,336
	0,3316
	67,117
	40
	1,6779
	11
	3,0
	0,34
	0,326
	0,3
	0,3220
	64,700
	40
	1,6175
b) Construir um gráfico de Michaelis-Menten para a α-glicosidase (velocidade inicial pela concentração de substrato no tubo de ensaio). 
c) Construir um gráfico de Lineweaver-Burk (1/V pela1/[S)] 
d) Determinar Km e o Vmax da α-glicosidase
Utilizando a fórmula da reta (y=0,118x+0,0022), levando-se em conta que quando x=0, y=1/vMax e quando y=0, x=1/kM, temos
vMax= 454,55 nMol/min
kM=0,186
3. Padrão de inibição da α-glicosidase pela maltose. Para obter esta informação, será necessário: 
a) Calcular a velocidade inicial (nmol/min) da reação em todos os tubos da P8, inclua os dados dos demais grupos
	tubos
	[S] final (mM)
	[I] final (mM)
	Réplica 1
(A420)
	Réplica 2
(A420)
	Réplica 3
(A420)
	Média
(A420)
	Produto (nmols)
	Tempo de reação (min)
	1 A
	0,2
	0,1
	0,097
	0,092
	0,107
	0,0987
	8,8666
	40
	1 B
	0,2
	0,1
	0,083
	0,096
	0,081
	0,0866
	5,8666
	40
	2 A
	0,5
	0,1
	0,130
	0,137
	0,136
	0,1343
	17,7833
	40
	2 B
	0,5
	0,1
	0,139
	0,160
	0,143
	0,1473
	21,0333
	40
	3 A
	0,8
	0,1
	0,170
	0,162
	0,170
	0,1673
	26,0333
	40
	3 B
	0,8
	0,1
	0,170
	0,155
	0,144
	0,1563
	23,2833
	40
	4 A
	1
	0,1
	0,174
	0,173
	0,169
	0,1720
	27,2000
	40
	4 B
	1
	0,1
	0,177
	0,170
	0,157
	0,1680
	26,2000
	40
	5 A
	2
	0,1
	0,234
	0,237
	0,265
	0,2453
	45,5333
	40
	5 B
	2
	0,1
	0,250
	0,257
	0,278
	0,2616
	49,6166
	40
	6 A
	3
	0,1
	0,259
	0,272
	0,276
	0,2690
	51,4500
	40
	6 B
	3
	0,1
	0,290
	0,291
	0,265
	0,2820
	54,7000
	40
Foram feitas as médias entre A e B:
	tubos
	Média
(A420)
	Velocidade
(nmols/min)
	1/V
	1/S
	1 
	7,366
	0,1841
	5,4298
	5
	2
	19,408
	0,4852
	2,0609
	2
	3
	24,658
	0,6164
	1,6221
	1,25
	4
	26,700
	0,6675
	1,4981
	1
	5
	47,575
	1,1893
	0,8407
	0,5
	6
	53,075
	1,3268
	0,7536
	0,33
	tubos
	[S] final (mM)
	[I] final (mM)
	Réplica 1
(A420)
	Réplica 2
(A420)
	Réplica 3
(A420)
	Média
(A420)
	Produto (nmols)
	Tempo de reação (min)
	7 A
	0,2
	0,3
	0,104
	0,178
	0,099
	0,0683
	4,7875
	40
	7 B
	0,2
	0,3
	0,098
	0,101
	0,142
	0,0905
	4,5375
	40
	8 A
	0,5
	0,3
	0,194
	0,207
	0,151
	0,1086
	17,162
	40
	8 B
	0,5
	0,3
	0,157
	0,172
	0,161
	0,1540
	12,475
	40
	9 A
	0,8
	0,3
	0,247
	0,243
	0,251
	0,1470
	22,975
	40
	9 B
	0,8
	0,3
	0,237
	0,231
	0,254
	0,1950
	21,300
	40
	10 A
	1
	0,3
	0,287
	0,261
	0,323
	0,2220
	26,350
	40
	10 B
	1
	0,3
	0,347
	0,314
	0,34
	0,2260
	33,800
	40
	11 A
	2
	0,3
	0,685
	0,652
	0,671
	0,2260
	75,725
	40
	11 B
	2
	0,3
	0,551
	0,585
	0,581
	0,5510
	63,600
	40
	12 A
	3
	0,3
	0,75
	0,776
	0,787
	0,5783
	88,475
	40
	12 B
	3
	0,3
	0,758
	0,73
	0,73
	0,8573
	88,475
	40
Foram feitas as médias entre as duplicatas A e B:
	tubos
	Média
(A420)
	Velocidade
(nmols/min)
	1/V
	1/S
	7
	4,662
	0,1165
	8,5790
	5
	8
	14,818
	0,3700
	2,6992
	2
	9
	22,162
	0,5540
	1,8048
	1,25
	10
	30,075
	0,7518
	1,3300
	1
	11
	69,662
	1,7415
	0,5741
	0,5
	12
	86,475
	2,1618
	0,4625
	0,33
b) Construir gráficos de Lineweaver-Burk na presença de concentrações diferentes de inibidor (1/V pela 1/[S)] 
vMax tubo 1 a 6 = 2,8021
kM tubo 1 a 6=0,3565
vMax tubo 7 a 12 = 2,5953 nMol/min
kM tubo 7 a 12=0,2175
c) Determine o padrão de inibição da α-glicosidase pela maltose. 
Pela tabela anterior percebe-se que o valor da velocidade máxima permaneceu quase constante, porém o valor de Km mudou consideravelmente o que indica uma inibição competitiva entre a maltose e o p-nitrofenolato, isto é, ambos reagentes competem pelo mesmo sítio ativo, o que confirma a análise anterior do gráfico. 
A inibição competitiva deve-se ao fato se que tanto a maltose como o p-nitrofenolato apresentam estruturas semelhantes e podem reagir com o sítio catalítico da α-glicosidase. 
Além disso, o relatório deverá conter as respostas das seguintes perguntas: 
Por que é necessário dialisar as amostras antes de correr o gel? 
A diálise serve para remover o excesso de sais presentes na amostra. As cargas dos íons salinos interagindo com as proteínas podem facilitar sua precipitação no solvente, tornando-as inadequadas para a corrida em gel de eletroforese.
Qual a razão de se fazer um gel de empilhamento em cima do gel de separação? 
O gel de empilhamento apresenta propriedades ligeiramente diferentes do gel de corrida. Seu pH é em torno de 6,8 e ele contém menos acrilamida, o que confere a ele uma estrutura mais porosa. Estas característcias permitem que todas as proteínas se acumulem em uma fina banda única antes de entrarem no gel de corrida, fazendo com que todas as bandas partam ao mesmo tempo no experimento e melhorando a resolução do resultado.
Qual o papel do SDS? 
	O SDS é utilizado como padrão, ele é uma amostra que contem vários tamanhos de proteínas pré-selecionadas que ao correr junto a amostra pode servir como parâmetro de comparação para o peso molecular da amostra desconhecida.
Como o peso molecular calculado se compara com o peso molecular estimado por outros trabalhos? 
O peso molecular calculado foi de 65-70 kda já na literatura[6.1] [6.2] o peso da alpha-glucosidase está entre 45-60 kda o que mostra que nossa estimativa não se assemelha aos trabalhos pré publicados, o que indica também erro experimental.
Elabore uma hipótese de como a maltose funciona como um inibidor da α-glicosidase
A maltose tem a estrutura muito parecida com a sacarose, por isso a enzima alpha glucosidase pode ligar-se a ela de maneira similar ao que ocorreria com a sacarose, ocorrendo assim a competição. A maltose também poderia ligar-se mais fortemente à enzima do que a sacarose, fazendo com que a alpha glicosidase fosse sequestrada e não interagisse com a sacarose.