Roteiro de estudo - Prova prática de machos

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AULAS DE 
REPRODUÇÃO
DO 5º SEMESTRE –
ANO DE 2016
Exame Andrológico – usando o cão como exemplo
 Antes é preciso relembrar um pouco de nomes, anatomia e localização:
*o software utilizado foi o 3D Dog Anatomy da Biosphera*
Cão por fora.
Estrutura marcada em amarelo é o escroto.
*esta estará marcada nos slides seguintes da mesma forma.
Musculatura do cão.
Visualização das 
estruturas em
meio a musculatura
do animal.
*Junto com nervos, vaso
s e órgãos de 
outros sistemas.
*estrutura marcada em laranja
é o bulbo
**estará marcada nos slides 
seguintes
Ossatura do cão.
Visualização das 
estruturas em
meio os ossos
do corpo.
Contorno do corpo do cão.
Visualização das 
estruturas livres 
no corpo do animal.
Arrumando o laboratório para avaliação do sêmen
 Ligar o banho maria, a centrifuga, o microscópio, a balança, a geladeira e a placa térmica (todos os equipamentos)
 Colocar os materiais sobre a placa aquecida (laminas, lamínulas, ponteiras para pipetar...)
 Separar a câmara de Neubauer, o teste de pH, as pipetas, béquer, palhetas... (os equipamentos necessárias para os 
exames seguintes)
 Colocar formol, água e solução fisiológica no banho maria a 37°C
 O laboratório deve ser preparado para todos os exames que virão em seguida. Com os equipamentos em mãos e as 
bancadas organizadas os próximos passos poderão ser seguidos.
Botão de 
ajuste da 
temperatura 
da placa 
aquecida
Materiais sobre 
a placa 
aquecida
Voltagem das 
tomadas do 
laboratório
Câmara de Neubauer
Pipetas para os exames seguintes
Ponteiras 
Lâminas
Lamínulas
Corantes para o esfregaço
Fitas de pH
Montando a vagina artificial
 Vagina artificial de equinos: materiais
Copo para coletar 
o sêmen
Garrafa
para colocar
o copo de coleta
Camisa de látex 
para revestir a vagina
Plástico para
revestir a 
vagina por
cima do látex
Suporte para a
vagina artificial
 Vagina artificial de equinos: montagem
1. A camisa de látex deve ser passada dentro do suporte pela 
área demarcada
2. Dobrar as pontas da camisa para fora e encaixá-las na parte 
marcada
3. Quando ela for dobrada ambas as pontas devem ser 
amarradas por elásticos
4. O plástico deve ser passado por dentro do suporte e ter 
apenas a ponta mais afastada da válvula (marcada) 
amarrada por um elástico
5. Na outra ponta (mais próxima da válvula) será anexado a 
garrafa para coleta
6. Deve ser colocada água a 42°C para mimetizar a pressão e a 
temperatura de uma vagina real de égua
1
2
4
*O copo para coleta do 
sêmen deve estar dentro
da garrafa antes da 
mesma ser anexada*
5
*para anexar a garrafa ao plástico é preciso:
1. Passar o plástico pela tampa da garrafa
2. Alinhar o plástico na rosca da garrafa
3. Rosquear bem a tampa em cima do 
plástico*
Vagina artificial montada
 Vagina artificial de ruminantes: materiais e montagem
Pipeta
Elástico
Funil 
de látex
Camisa 
de látex
Tubo
rígido
Elástico
1. A camisa de látex deve ser passada dentro do tubo 
2. Dobrar as pontas da camisa para fora e encaixá-las 
3. Quando ela for dobrada ambas as pontas devem ser 
amarradas por elásticos
4. O funil deve ser encaixado por fora do tubo e ser 
amarrado com um elástico
5. Na ponta do funil será anexada a pipeta para coleta
6. Deve ser colocada água a 42°C (no caso de grandes 
ruminantes) e ar (no caso da de pequenos ruminantes 
e a temperatura seria 60°C) para mimetizar a pressão 
e a temperatura de uma vagina real
Pequenos Ruminantes
Bovinos
*A pipeta deve ser revestida com 
papel comum ou papel alumínio*
*É para proteger o sêmen*
Pipeta
 Vagina artificial de cães: materiais e montagem
 Montagem:
1. O látex pequeno deve ser encaixado a pipeta de coleta
2. O látex com a pipeta devem ser colocados dentro da mamadeira
3. Na mamadeira deve ser colocada água a 37°C para mimetizar a vagina 
da cadela ate cobrir a pipeta de coleta
4. A mamadeira devera ser rosqueada de tal forma que prenda o látex e 
a pipeta
5. O funil pequeno devera ser encaixado na rosca da mamadeira
Mamadeira já vedada
Funil pequeno
Tampa da mamadeira
 Materiais:
 Uma mamadeira que devera ser vedada com papel alumínio para 
proteger o sêmen
 Uma pipeta de coleta
 Água a 37°C para mimetizar a vagina da cadela 
 Látex redondo e pequeno para caber na mamadeira
*IMPORTANTE PARA O PRÓXIMO PASSO*
Conta como 
um aumento 
visual de 10X
Lente de 
aumento 
de 4X
Lente de 
aumento 
de 10X
Lente de 
aumento 
de 40X
Avaliando o sêmen
 Macroscopicamente:
• As avaliações são feitas diretamente no tubo de coleta de forma visual
 Aspecto: soroso, leitoso ou cremoso
 Cor: avaliar na hora o sêmen (sangue presente = avermelhada – por exemplo)
 Volume: avaliar pipeta de coleta
 Odor: se nenhum odor diferente do látex for sentido deve-se escrever suis generes na resposta
 pH: utilizar ponteira para pipetar 20 µl de sêmen e colocar na faixa colorida da tira de pH para avaliação (Img 1)
 Movimento de massa: *em pequenos ruminantes* presente ou ausente
Img 1
 Microscopicamente:
• As avaliações são feitas visualmente pelo microscópio; no decorrer do teste a luz do microscópio e o diluidor matam os 
SPTZ, portanto a avaliação deve ser feita o mais rápido possível
 Turbilhonamento: *em pequenos ruminantes* nota de 1 a 5 (baseada logo na primeira visualização pelo microscópio)
 Para esta avaliação usamos a lente de aumento 4X
 MPR: *sêmen do carneiro deve ser diluído em solução fisiológica* em porcentagem (basear-se na primeira visualização)
 Para esta avaliação e a seguinte usamos a lente de aumento 10X
 Vigor: nota de 1 a 5 – avaliar movimentação dos espermatozoides (basear-se na primeira visualização)
 Concentração: Câmara de Neubauer (olhar slide seguinte)
Câmara de Neubauer – contagem manual de sêmen
Primeiro Passo
A área destacada em verde deve ter saliva passada sobre si 
para oferecer resistência a lamínula que vira por cima em seguida
Segundo Passo
A lamínula deve ser apoiada nas duas abas onde a saliva foi passada 
e deve deixar pequenos espaços em ambas das
partes superior e inferior da câmara
Lamínula // Espaço superior // Espaço inferior
Proporções para diluição: 1:10 1:20 1:50 1:100 1:200 1:400 1:600 1:800 1:1000
Diluições para amostras de sêmen
que são mais diluídas – como a do cão
Diluições intermediárias
Diluições para amostras
de sêmen mais 
concentradas – como
a de ruminantes
*IMPORTANTE PARA O PRÓXIMO PASSO*
◊ A amostra de sêmen (no caso da aula)
possui 20 µl (microlitros) 
e é uma amostra de um pequeno ruminante
(que estava extremamente concentrada)
◊ A diluição escolhida
foi a de 1:1000
1 – 1000
0,02 – X 
*OBS..: 20 µl equivalem a 0,02 ml
X = 20 ml
Terceiro Passo
• Deve-se descobrir o quanto de água será utilizada para a diluição do sêmen após a 
escolha da proporção de diluição
• A água deve ser utilizada pela necessidade dos espermatozoides 
estarem paradas para a contagem
Quarto Passo
• Pegar dois copos de béquer – uma com água e outro sem
• Usar a pipeta de vidro grande (10 ml) para sugar 20 ml de água e transferi-los para o outro copo
• Após colocar estes 20 ml no copo, retirar 20 µl desta água para seguir para o próximo passo
Béquer Pipeta *Para segurar a água dentro da pipeta deve-se colocar o dedo nesta saída de ar*
Quinto Passo
• Pegar 20 µl de sêmen puro
• Limpar a ponteira com papel antes de coloca-la dentro do béquer
• Injetar o sêmen no copo de béquer
• Homogeneizar manualmente o conteúdo do copo
• Em seguida limpar a ponteira dentro do conteúdo do copo
Sexto Passo
*Uma nova ponteira deve ser usada*
• 20 µl de sêmen devem ser coletados do béquer
• Essa quantidade deve serinjetada nestas duas regiões destacadas
*A quantidade deve ser suficiente para preencher os quadrados marrons*
*O sêmen deve ser injetado entre a lâmina da câmara e a lamínula*
Cada uma 
dessas 
possui 
a seguinte 
aparência
Cada um 
desses 
possui 
a seguinte 
aparência
Cada uma
dessas 
possui 
a seguinte 
aparência
*Elas são
triplas*
1 2
34
5
Apenas 5 dos 25 quadrados 
deverão ter seu número de
espermatozoides contabilizados
*nesta sequência*
*Os espermatozoides 
parados neste
“L” também são 
contabilizados*
Sétimo Passo
 Durante a aula..: a conta ficou da seguinte forma:
• Quadrado 1: 59 // Quadrado 2: 75 // Quadrado 3: 70 // Quadrado 4: 57 // Quadrado 5: 58
• Total: 319
*Obs..: os dois devem ser contados conforme o esquema a cima e seus resultados
somados e este valor dividido por dois para se ter uma média e 
não deve haver a chapa aquecida no microscópio
*Ressalva: na aula não foram contados os dois quadrados marrons *
*para chegar do 4 ao 5 deve-se 
subir dois quadrados e ir dois 
quadrados para o lado*
[ ] (concentração) = ∑ x 5 x 10 x 1000 
De espermatozoides
(SPTZ) na diluição Valor alcançado pela 
divisão do número 
vindo da soma de 
ambas as “caixas” ( )
da câmara
Para dar os 
25 
Quadrados
das 
“caixas” da
câmara
Quantidade que cabe em 
cada “caixa” (mm³)
Proporção de 
diluição escolhida
[ ] (concentração) = 319 x 5 x 10 x 1000 = 15.950.00 SPTZ/mm³ 
O resultado deve ser 
em ml, portanto, 
deve-se multiplicar 
este valor por 1000
*1mm³ = 1000 ml*
[ ] (concentração) = 319 x 5 x 10 x 1000 = 15.950.00 SPTZ/mm³ = 15.950.000.000 SPTZ/ml
Este valor pode ser resumido
Oitavo passo (último)
*IMPORTANTE PARA OS PRÓXIMOS TESTES*
• Defeitos maiores são aqueles que impedem de alguma forma a fertilização
• Defeitos menores são aqueles que de alguma forma dificultam a chegada do espermatozoide ao óvulo
Diadema: pequenas 
invaginações no 
acrossôma
Persistência do
granulo do 
acrossôma
DEFEITOS MAIORES:
Cauda fortemente enrolada
DEFEITOS MAIORES:
Gota citoplasmática proximal Peça intermediária 
dupla
Peça proximal em 
formato de 
saca-rolha
Cauda dupla Peça 
intermediária 
e cauda dupla
Gota 
citoplasmática 
proximal e 
granulo no 
acrossôma
Gota 
citoplasmáti
ca proximal 
e cabeça 
piriforme
Gota citoplasmática proximal
DEFEITOS MAIORES:
Peça 
intermediária 
dupla
Acrossôma 
enrugado
Cabeça pequena
e deformada
Peça 
intermediária 
dobrada
Cabeça globosa 
com grânulos 
no acrossôma
Cabeça piriforme
Cauda
fortemente 
enrolada na 
cabeça do SPTZ
Cabeça em medusa
DEFEITOS MENORES:
Cauda 
dobrada
Cauda dobrada 
e gota 
citoplasmática 
distal
Cabeça 
afilada
Gota citoplasmática distal Plantação abaxial
T
O
D
O
S
O
S
D
E
F
E
I
T
O
S
Esfregaço de lâmina – avaliação de patologias
1. Diluir sêmen em solução fisiológica
2. Pipetar uma amostra do sêmen diluído
3. Injetar o sêmen na lâmina próximo ao seu lado fosco
4. Realizar o raspado 
5. Esperar secar para que as células morram 
6. Colocar a lâmina no corante 1 panótico por 30 segundos
7. Retirar do corante 1 e deixar 5 segundos escorrendo
8. Colocar a lâmina no corante 2 panótico por 30 segundos
9. Retirar do corante 2 e deixar 5 segundos escorrendo
10. Coloca a lâmina no corante 3 panótico por 20 segundos
11. Lavar a lâmina com água corrente
12. Deixar a lâmina secar 
Obs..: a lâmina necessariamente 
deve estar sobre a placa aquecida
4.
1. Colocar uma lâmina paralela a que possui a 
gota de sêmen na altura da gota
2. Esperar o conteúdo deslizar um pouco na 
borda da lâmina paralela
3. Em seguida raspá-la para espalhar o 
conteúdo
1
2
3
 O esfregaço pode estragar a cauda dos espermatozoides, portanto 
não devem ser contabilizados os defeitos de cauda neste teste
 Este teste é muito bom para defeitos de cabeça – que são os
únicos avaliáveis neste teste
 Para este exame devem ser contabilizadas 200 células/espermatozoides
 Se neste teste a cabeça de um espermatozoide estiver muito clara
significa ausência de acrossôma
Fixação de lâmina – avaliação de patologias
1. Pipetar uma amostra do sêmen puro
2. Injetar o sêmen em formol salina
3. Homogeneizar 
4. Pipetar uma amostra do sêmen fixado no centro da lâmina
5. Colocar a lamínula sobre o sêmen pipetado na lâmina
6. Vedar os quatro lados da junção da lamínula com a lâmina com esmalte
7. Esperar o esmalte secar e mais 24 horas
2. Assim que o sêmen cair no formol ele ira fixar; 
ou seja, ele ira ficar ‘estático’ na posição 
em que caiu
7. No caso da aula ou prova o teste deve ser 
Realizado logo após a secagem do esmalte 
ou até mesmo antes
 Todas as patologias podem ser avaliadas neste teste
 A lâmina deve ser ‘rastreada’ em busca das patologias
 Para este exame devem ser contabilizadas 200 
células/espermatozoides
 Ao encontrar uma patologia ela deve ser anotada junto ao 
numero do espermatozoide onde ela foi achada
 Sempre a pior patologia deve ser anotada quando o 
espermatozoide possuir mais de uma
 No final deve ser feita a porcentagem de incidência de cada 
patologia naquela amostra de sêmen
Fazendo e Calculando um Diluidor
 Antes de começar é preciso ter os seguintes materiais
separados
1. Béquer
2. Ovo
3. Filtro
4. Proveta
5. Água destilada
6. Citrato de sódio
7. Vara para misturar/homogeneizar
8. Capilar de vidro
9. Mistura de estreptomicina e penicilina
10.Pipeta de vidro 
11.Pote coletor
12.Pedaço de papel alumínio
13.Placa de petri
14.Glicerol
15.Algodão 
1
3
4
7
8
10
11
12
2
13
 Para fazer o diluidor é preciso:
1. Pesar exatos 1,47 gramas de citrato de sódio em cima do papel alumínio
2. Colocar 50 ml de água destilada na proveta
3. Despejar o citrato de sódio no béquer e em seguida a água destilada
4. Homogeneizar com a vareta
5. Lavar o ovo com água corrente e sabão; em seguida passar um algodão com álcool na casca
6. Quebrar um pouco o ovo sem danificar a gema para despejar a clara na placa de petri
7. Colocar a gema no filtro
8. Mexer um pouco a gema no filtro para que ele absorva o restante da clara
9. Levar a gema até a ponta do filtro
10.Mirar exatamente no centro da proveta
11.Furar de vidro a gema do ovo com o capilar
12.Deixar cair a gema até 10 ml
13.Despejar o conteúdo do béquer na proveta ate dar 50 ml
14.Homogeneizar com a vareta
15.Pesar exatamente 0,1 grama da mistura de estreptomicina e penicilina
16.Colocar na proveta e homogeneizar novamente
17.Retirar 3,5 ml da proveta utilizando a pipeta de vidro e despejá-los no béquer
18.Colocar 3,5 ml de glicerol no lugar do 3,5 ml retirados (representa 7% de 50 ml)
19.Homogeneizar novamente
20.Despejar o conteúdo da proveta no pote coletor
*OBS*
Todos os componentes 
que são necessários para fazer 
o diluidor e que não fazem
parte do equipamento do 
laboratório deverão estar 
disponíveis na hora
 Para calcular o volume necessário de diluidor para uma determinada dose inseminante (pt. 1) é preciso: 
1: dados do animal
1. [ ] total de SPTZ = [ ] SPTZ/ml . Volume
2. [ ] SPTZ viáveis na amostra = [ ] total de SPTZ . MPR
3. Numero de palhetas = [ ] SPTZ viáveis ÷ dose inseminante
4. Volume total = numero de palhetas . Volume de uma palheta
5. Volume de diluidor = volume total – volume de sêmen
2: saber as contas e suas sequências de execução 
3: realizar os cálculos
*esta conta é 
valida se o 
congelamento 
não for ser 
realizado*
 Para calcular o volume necessário de diluidor para uma determinada dose inseminante (pt. 2) é preciso: 
1: dados do animal
1. [ ] total de SPTZ = [ ] SPTZ/ml . Volume
2. [ ] SPTZ viáveis na amostra = [ ] total de SPTZ . MPR
3. [ ] SPTZviáveis após congelamento = [ ] SPTZ viáveis . Porcentagem de perda (*professora vai fornecer)
4. Numero de palhetas = [ ] SPTZ viáveis ÷ dose inseminante
5. Volume total = numero de palhetas . Volume de uma palheta
6. Volume de diluidor = volume total – volume de sêmen
2: saber as 
contas e 
suas 
sequências 
de execução 
3: realizar os cálculos
*esta conta é 
valida se o 
congelamento 
for ser 
realizado*
V = 2 ml
[ ] = 3,5 . 10⁹ SPTZ/ml
MPR = 80%
Dose inseminante = 100 milhões (dose do carneiro)
Volume de uma palheta = 0,5 ml
Porcentagem de perda no congelamento = 50%
1. 3,5 . 10⁹ . 2 = 7 . 10⁹ SPTZ totais
2. 7 . 10⁹ . 0,8 = 5,6 . 10⁹ SPTZ viáveis
3. 5,6 . 10⁹ . 0,5 = 2,8 . 10⁹ SPTZ viáveis
4.
2.800.000.000
100.000.000
= 28 palhetas
5. 28 . 0,5 = 14 ml volume total
6. 14 – 2 = 12 ml volume diluidor
 Para calcular o volume necessário de diluidor para um cachorro (pt. 3) é preciso: 
1: dados do animal
1. [ ] total de SPTZ = [ ] SPTZ/ml . Volume
2. [ ] SPTZ viáveis na amostra = [ ] total de SPTZ . MPR
3. [ ] SPTZ viáveis após congelamento = [ ] SPTZ viáveis . Porcentagem de perda (*professora vai fornecer)
4. Numero de palhetas = [ ] SPTZ viáveis ÷ dose inseminante
5. Volume total = numero de palhetas . Volume de uma palheta
6. Volume de diluidor = volume total – volume de sêmen
2: saber as 
contas e 
suas 
sequências 
de execução 
3: realizar os cálculos
*No cão, suíno e equino é preciso 
centrifugar o sêmen por 5 minutos.*
V = 11,5 ml
[ ] = 15 . 10⁷ SPTZ/ml
MPR = 80%
Dose inseminante = 100 milhões (dose do cão)
Volume de uma palheta = 0,25 ml
Porcentagem de perda no congelamento = 50%
1. 15 . 10⁷ . 11,5 = 172,5 . 10⁷ SPTZ totais
2. 172,5 . 10⁷ . 0,8 = 138 . 10⁷ SPTZ viáveis
3. 138 . 10⁷ . 0,5 = 69 . 10⁷ SPTZ viáveis
4.
690.000.000
100.000.000
= 6,9 palhetas → 6 palhetas
5. 6 . 0,25 = 1,5 ml volume total
*Deve-se colocar um segundo tubo na 
centrifuga com o mesmo volume da 
amostra para balancea-la.*
*depois da centrifuga o plasma deve ser 
jogado fora e o sêmen restante deve ser 
diluido.*
*Por este motivo o volume total também 
sera o volume do diluidor.*
Congelação do sêmen
 Primeiro vamos colocar a sequência de atividades a serem seguidas:
1. Colheita do sêmen
2. Avaliação do sêmen
3. Conta de diluição
4. Diluição
5. Identificação de palhetas
6. Envasamento
7. Refrigeração
8. Congelação
9. Testes pós congelamento
 O que é e como identificar as palhetas
Palheta 
de 0,25 ml
• Esta ponta da palheta tem algodão
+ álcool polivinilico.
• O álcool polivinilico é em pó e endurece 
quando em contato com líquido.
• Quando o álcool endurece ele lacra a 
palheta e o líquido não escapa mais.
No corpo da palheta 
colocamos o nome do 
animal + a data de coleta 
do sêmen
 Envasamento
1. Puxar o sêmen para dentro das palhetas (sugando ou com uma seringa)
2. Fazer bolhas de ar (para quando for congelado e ocorrer a expansão não estourar a palheta e estragar o sêmen)
3. Colocar a ponta da palheta – que não possui algodão – no álcool polivinilico (Img 1)
4. Colocar esta ponta na água para endurecer o álcool (Img 2)
5. Secar com papel
Img 1Img 2
 Refrigeração
 Colocar na geladeira por 20 minutos a 5°C
 Congelação
1. Colocar nitrogênio liquido ate a marca de 3 cm da geladeira de isopor
 O nitrogênio esta a – 196° e vai gerar um vapor de – 120°
 Devem haver dois suportes a 4 cm do nitrogênio liquido
2. Apoiar as palhetas nos suportes
3. Deixar 20 minutos no vapor do nitrogênio 
*as medidas devem ser confirmadas com a régua especial*
 Testes pós congelação
 Serve para saber se o sêmen é viável para guardar/congelar/preservar
 Uma palheta será descongelada para o teste
1. Descongelar uma palheta a 37°C em banho maria
2. Avaliar se possuí MPR maior ou igual a 30%
3. Realizar esfregaço para avaliar se possui um numero maior ou igual de 70% de acrossôma íntegros
4. Teste de termo resistência: 1: deixar o sêmen a 38°C por 5 horas (ruminantes) ou 30 minutos (equinos); 2: MPR deve estar 
maior ou igual a 20% no final do teste
 Se o sêmen passar nos testes ele poderá ser congelado
• Usar uma pinça e colocar 5 palhetas de cada lado de um hack, guarda-lo em um caneco e pendura-lo no botijão de 
nitrogênio liquido – que deve ter no mínimo 15 cm de conteúdo 
Hack: cabem 10 palhetas em cada
Caneco: cabem 10 hacks em cada
Esta aula foi feita pela aluna Thaís Reichmann de 
Oliveira do 5º semestre do curso de Medicina 
Veterinária da Universidade Anhembi Morumbi 
baseada nas aulas das professoras Silvia Ferrari 
e Liege Garcia. Houve base, também, nas aulas 
de Corpo Animal 2 ministrada pelos professores 
Roberto Foz, Marcelo Lima, Flavio Santos e 
Rafael Magdanelo (2º semestre); e nas aulas de 
Função e Disfunção 1 e 2 ministradas pelos 
professores Edson Pereira, José Guerra, 
Luciano e Carolina Pita (3º e 4º semestre).