Relatório de HPLC: Análise de Cafeína

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Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro – Campus Duque de Caxias
Ciclo de práticas
Prática 1: HPLC Quali
Duque de Caxias
2015
Índice
INTRODUÇÃO........................................................................................
OBJETIVO..............................................................................................
MATERIAS E REAGENTES .................................................................. 
PROCEDIMENTO...................................................................................
RESULTADO E DISCUSSÃO.................................................................
CONCLUSÃO.........................................................................................
BIBLIOGRAFIA.......................................................................................
Introdução
 A Cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica que se tornou moderna apenas nos anos 70 e que é utilizada frequentemente nos laboratórios atualmente, e que utiliza colunas de pequeno porte, que possuem recheios especialmente preparados e onde ocorre a eluição da fase móvel sobre altas pressões. Na CLAE, a fase estacionária e a fase móvel são responsáveis pela retenção dos compostos, ocorrendo entre eles forças físicas (como as interações eletrostáticas e coulombianas, a forças de Van Der Waals, entre outras) e químicas, sendo a fase estacionária formada por partículas sólidas empacotadas em uma coluna, e a fase móvel sendo um solvente ou uma mistura de solventes de alta pureza (grau HPLC). O processo cromatográfico é baseado no processo da partição, que é a concentração do soluto na fase móvel e na fase estacionária. Existem 5 tipos de fases estacionárias que possuem diferentes mecanismos, como: cromatografia líquido-sólido ou por adsorção, cromatografia líquido-líquido ou por partição, cromatografia líquida com fase ligada, cromatografia líquida por troca iônica e a cromatografia líquida por exclusão.
 Dentro dessa técnica podem haver tanto a análise qualitativa como a análise quantitativa. Na análise qualitativa, é feito uma comparação entre os tempos de retenção dos padrões e dos componentes da amostra após a corrida cromatográfica. O tempo de retenção é o tempo gasto por uma substância desde da injeção da amostra até o momento em que o máximo do pico sai da coluna, tendo cada componente um tempo de retenção característico e diferente de outros, podendo-se comparar a padrões.
Objetivo
 Esta prática tem por objetivo a identificação de cafeína na amostra, através da comparação dos tempos de retenção da amostra com o padrão, por HPLC. Além disso, se fez necessário o desenvolvimento de habilidades frente ao manuseio da técnico e também do software utilizado. Determinar as forças intermoleculares e a polaridade da amostra e do padrão, na identificação da ordem de saída. 
Procedimento
a) Preparo da fase móvel (Metanol 30% v/v)
 Nosso cromatógrafo possui duas bombas, portanto não foi necessária a preparação prévia da fase móvel, apenas foram feitos os ajustes no software que controla o equipamento e a mistura era feita pelo mesmo. 
b) Preparo da solução-estoque de cafeína
 A solução estoque de cafeína foi preparada pelos monitores antes do início da aula prática.
c) Preparo das soluções-padrão
 As soluções padrão foram preparadas pelo grupo 1 a partir da solução estoque preparada anteriormente. Foram preparadas cinco soluções, de concentrações iguais a 
d) Preparo das amostras
 As amostras também foram preparadas pelo grupo 1.
e) Condições cromatográficas
As condições foram ajustadas no software que controla o cromatógrafo. 
Fase móvel: metanol 30% em água;
Coluna: C18;
Vazão: 1,0 mL/min;
Detetor: UV-VIS,  = 272 nm;
Volume injetado: 20 L;
Tempo de corrida: 210 segundos;
f) Análise cromatográfica
 A primeira coisa a ser feita foi a programação do software, foram injetados 20µL, na prática, injetamos por volta de 80µL, para que seja possível que aconteça o rinse do loop, de água ultrapura, para nos certificarmos que não haviam impurezas ou contaminantes provenientes de outras análises que pudessem interferir em nossos resultados. Após feito a análise do branco, foi iniciada nossa análise. Antes de cada injeção a seringa foi lavada por 5 vezes com água ultra pura e rinsada com a solução que seria injetada, por 3 vezes também. As soluções foram sendo injetadas no cromatógrafo conforme as orientações do software, que como dito anteriormente, tinha sido ajustado para as nossas condições de análise. Após análise de cada solução, os dados desejados foram anotados e ao final, as soluções foram descartadas segundo as instruções do professor e a seringa foi lavada e guardada.
 
Resultado e discussão
Antes de expor os resultados, faz-se necessário conhecer as propriedades químicas das amostras e dos padrões para a definição das condições de trabalho utilizadas.
Cafeína
 Composto químico classificado como alcaloide do grupo das xantinas( quimicamente designada 1,3,7-trimetilxantina).Encontrado em certas plantas, é usado para o consumo de bebidas, na forma de infusão como estimulantes. Atuam sobre o sistema nervoso central, produzindo um certo estado de alerta de curta duração e aumentando a capacidade de trabalho do coração.
 Apresenta-se na forma de um pó branco, sem cheiro, cujo o ponto de fusão é de 236ºC e sublimam a 138ºC. Extremamente solúvel em água quente e de sabor amargo.
 Figura 1- Estrutura Química da Cafeína
Teobromina
É um alcalóide da família das metil-xantinas, da qual também fazem parte a teofilina e a cafeína (trata-se do 3,7-dimetilxantina) Normalmente encontrado no chocolate.
Figura 2- Estrutura Química da Teobromina
 Comparando as imagens (Figura 1 e 2 ) é possível estabelecer uma ordem de polaridade decrescente: Teobromina > Cafeína 
 Através desta propriedade química foi escolhido as melhores condições de análise, e a que se mostrou ( até o momento) mais satisfatório seguem abaixo:
-Fase estacionário: coluna de fase reserva (C18)
- Fase móvel: 30% de Metanol + 70% de água 
-Vazão: 1,0 mL/min;
-Detector: UV-VIS,  λ = 272 nm(comprimento de onda de ótima absorção das substâncias analisadas);
- Volume injetado: 20 μL(volume do loop), porém na seringa adicionamos por volta de 80 a 100 μL pra a rinsagem do loop;
-Tempo da corrida cromatográfica: 3,5 min. 
 Faz-se necessário também conhecer o equipamento utilizado na análise que permite realizar uma análise eficiente. Assim, segue abaixo um esquema sobre o HPLC:
 Figura 3- Esquema básico de um cromatógrafo para CLAE
1º Temos um reservatório que não reaja com o solvente, omde a captação para dentro da bomba é feita através de um filtro que não permite a entrada de sólidos possíveis(presentes no solvente) na bomba, podendo desgastar os pistões da mesma. Ao chegar na bomba, os solutos passam por uma degaseificação, através de ultra-som para não provocar cativação nas bombas e nem sangramento na coluna, caso cheguem a mesma.
2º Após isso, as substâncias são a um compartimento para a mistura dos solventes, passam por outros filtros que garantem a pureza da fase movél.
3º Na vávula Rheodyne, é injectado com uma seringa com um volume acima do necessário e determinado pelo loop, como descrito abaixo: 
Figura 4: Trata-se do modo load, quando adiciona-se a amostra através da seringa. Da bomba(3) a fase móvel passa direto pra coluna(4)por estar na posição load a válvula, onde se encontra desconectada do loop. Já da seringa(2) o volume adicionado passa para o loop, e por estar em volume superior a capacidade do mesmo para realizar rinsagem do mesmo , que ao transbordar, é levado ao descarte ao qual o loop se encontra conectado no modo load.Figura 4- Esquema da válvula de injeção na posição load
 Figura 5:Trata-se do modo inject,quando injeta-se a amostra na coluna. Neste a injeção da seringa(2) já foi feita, e no loop(5) já se encontra preenchido com o volume adequado. Quando colocamos a válvula na posição inject, temos a mudança da posição das tubulações, acontecendo a conexão do tubo da bomba(3) com o início do loop(2) e sua extremidade(5) a coluna(4), sendo a amostra levada a coluna com fluxo contínuo e constante pela fase móvel provida da bomba.Figura 5- Esquema da válvula de injeção na posição inject
Equipamento utilizado:
Bomba: marca= Waters; modelo=1525 Binary HPLC pump; principais características= seu fluxo de solvente livre de pulso, a partir de análise de taxas de fluxo semi-preparativas, os torna ideais para uso com detectores altamente sensíveis, além de uma mistura eficiente.
Detector UV-VIS: marca=Waters; modelo= UV-VIS 2489; principais características= detector versátil de duplo comprimento de onda para HPLC, oferece alta sensibilidade para aplicações de rotina baseadas em UV tais como identificação de impureza em baixos níveis e análises quantitativas. 
O que ocorreria com o TR da cafeína com o aumento do tamanho da coluna?
 Em geral, quando aumentasse a coluna, o tempo de retenção tende a aumentar. Não é diferente neste caso, logo, há um aumento no tempo de retenção e um possível alargamento dos picos.
Modificações esperadas se a proporção de água ultrapura e Metanol fosse aumentada na fase móvel.
1º Caso aumentemos a proporção de água ultrapura na fase móvel:
 Teríamos uma fase móvel mais polar, sendo as substâncias em análise mais apolares do que polares, ficarão mais tempo retidas na fase estacionária , havendo um aumento no tempo de retenção igualmente as dois analitos (teobromina e cafeína), com o deslocamento do espectro para a direita. 
2º Caso aumentemos a proporção de metanol na fase móvel :
 Teríamos uma fase menos polar, tendo uma redução no tempo de retenção, sendo as substâncias em análise mais apolares do que polares, ficarão menos tempo retidas na fase estacionária, por sua grande atração a fase móvel. 
A ordem de saída das substâncias:
 Segundo a estrutura das substâncias, sendo a cafeína mostra-se mais apolar e a teobromina se mostra menos apolar.
 A coluna (fase estacionária) trata-se de uma coluna apolar, na qual a cafeína ficará mais retida na mesma devido sua estrutura apolar e a teobromina ficará menos retida por ser menos apolar frente a cafeína. Logo a ordem de saída será: teobromina e cafeína respectivamente.
Análise qualitativa da amostra
A amostra mostrou dois picos significativos cujos valores estão representados abaixo, juntamente a as do padrão para fins comparativo:
	Nome
	Pico 1
	Pico 2
	
	Tempo de retenção(min)
	Tempo de retenção(min)
	Amostra 
	1,086
	1,932
	Padrão 1
	0,739
	1,955
 Tabela 1- Valores para comparação de Tempo de retenção para uma análise qualitativa
 Logo, sabendo que o tempo de retenção é característico de cada substância, foi possível determinar que o pico 2 da amostra coincide com o do padrão e trata-se da cafeína. Já o pico 1 da amostra não coincide com o do padrão que trata-se do da teobromina. Assim, a substância do pico 1 da amostra continua desconhecida e sem determinação específica. Sendo necessária uma pesquisa bibliográfica, com o estabelecimento de substâncias no desenvolvimento de novos padrões para ar comparativo. O conhecimento prévio da composição da amostra também pode ser útil nesta análise. Não pode-se afirmar a ausência de teobromina na amostra , pois esta pode estar fora do limite de detecção.
Conclusão
 Todos os objetivos foram alcançados com êxito, tendo a análise resultados satisfatórios, com a presença de cafeína na amostra, identificada a partir da comparação do tempo de retenção da amostra com o do padrão. Os principais cuidados com o sistema cromatográfico foram observados, além de sua importância para a conservação da eficácia do mesmo. As principais considerações, referentes a fase móvel(proporções da mistura), saída das substâncias no espectro segundo sua interações com as duas fases( de acordo com sua estrutura química) e a escolha de um detector adequado a análise, foram explorados, afim de sanar qualquer dúvida segundo o funcionamento do sistema cromatográfico.