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PURIFICAÇÃO DE 
PRODUTOS 
BIOTECNOLÓGICOS
Prof.ª Bárbara Flaibam
Biotecnologia – Eng. Química
2º semestre de 2013
PROCESSOS DE PURIFICAÇÃO
DIVERSIDADE
IMPORTÂNCIA DOS 
PRODUTOS 
BIOTECNOLÓGICOS
DESENVOLVIMENTO 
DE PROCESSOS DE 
PURIFICAÇÃO
PROCESSOS DE PURIFICAÇÃO
ACONDICIONAMENTO
Operações para acondicionamento final do produto.Operações para acondicionamento final do produto.
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
Separação de classes de moléculas com algumas características físico-
química semelhantes.
Separação de classes de moléculas com algumas características físico-
química semelhantes.
CONCENTRAÇÃO OU PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
Separação da molécula alvo das demais com características físico-químicas 
diferentes.
Separação da molécula alvo das demais com características físico-químicas 
diferentes.
CLARIFICAÇÃO
Separação das células e seus fragmentos.Separação das células e seus fragmentos.
PROCESSOS DE 
PURIFICAÇÃO
PROCESSOS DE PURIFICAÇÃO
Etapa do processo Operações Unitárias
CLARIFICAÇÃO Filtração convencional; centrifugação;
filtração tangencial; floculação.
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
Homogeneização; moagem em 
moinho de bolas; rompimento 
químico ou enzimático.
PURIFICAÇÃO DE BAIXA 
RESOLUÇÃO
Precipitação; ultrafiltração; extração 
em sistemas de duas fases líquidas.
PURIFICAÇÃO DE ALTA 
RESOLUÇÃO
Cromatografia de troca iônica, de 
afinidade (biológica ou química), de 
fase reversa ou de exclusão 
molecular.
TRATAMENTOS FINAIS Cristalização; liofilização; secagem.
PROCESSOS DE PURIFICAÇÃO
OPERAÇÕES UNITÁRIAS utilizadas dependem: 
• Do uso da molécula alvo;
• Das suas características físico-químicas;
• Bem como, as características das impurezas.
• Produtos terapêuticos = maior nível de pureza = 
complexidade da purificação é elevada.
• Custo da purificação pode chegar a 80% do custo 
final do produto.
CLARIFICAÇÃO
- Filtração convencional
- Filtração tangencial
- Centrifugação
- Filtração convencional
- Filtração tangencial
- Centrifugação
CélulasCélulas
Meio de cultivo isento de 
células (clarificado ou 
filtrado)
Meio de cultivo isento de 
células (clarificado ou 
filtrado)
Primeira operação unitária do processo de purificação: 
separa as células suspensas do meio de cultura.
CLARIFICAÇÃO
FILTRAÇÃO CONVENCIONAL
• Aplica-se à clarificação
de grandes volumes
de suspensões diluídas
de células;
• Da ordem de milhares
de litros;
• Situações na qual a
assepsia não é
necessária.
FILTRAÇÃO CONVENCIONAL
SUSPENSÃOSUSPENSÃO
Meio filtranteMeio filtrante
Fração que atravessa o 
meio: FILTRADO
Fração que atravessa o 
meio: FILTRADO
Células depositadas sobre 
o meio: TORTA DE 
FILTRAÇÃO
Células depositadas sobre 
o meio: TORTA DE 
FILTRAÇÃO
Sob pressãoSob pressão PerpendicularmentePerpendicularmente
CENTRIFUGAÇÃO
SEDIMENTAÇÃO
Centrifugação = nada mais é que a aceleração da sedimentação por 
aplicação de um campo gravitacional centrífugo. 
FORÇA DA GRAVIDADE
CÉLULAS EM SUSPENSÃO
CENTRIFUGAÇÃO
• CENTRIFUGAÇÃO: resultam soluções mais
concentradas em relação à original.
• FILTRAÇÃO: dá origem a uma torta
relativamente seca, o que constitui uma
vantagem desta operação em relação à
centrifugação.
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Produtos associados às células requerem o 
rompimento ou a permeabilidade destas.
CÉLULAS MICRORGANISMOS
Possuem paredes rígidas e que exigem elevadas tensões de 
cisalhamento para serem rompidas.
CÉLULAS ANIMAIS
Membranas frágeis e fáceis de serem rompidas.
Diferentes estruturas de paredes celular
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Tamanho da célula
Tolerância à tensão de cisalhamento
Rendimento
Especificidade
Necessidade de controle de temperatura
Custo de operação
Capital investido
A escolha da forma de rompimento deve-se considerar:
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Métodos enzimáticos de rompimento de células
• Adequados para biomoléculas
sensíveis à tensão de cisalhamento
ou pressão de trabalho mecânicos.
• Hidrolisam a parede celular das
células microbianas.
• Quando parte da parede é
removida, a pressão osmótica
interna rompe a membrana
citoplasmática, permitindo que o
conteúdo intracelular seja liberado
do meio externo.
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Métodos enzimáticos de rompimento de células
• Paredes das leveduras são diferentes das bactérias.
• Possuem duas camadas principais, sendo uma
externa proteína-manana e uma interna de glucana.
• O sistema enzimático é composto de enzimas
diferentes como glucanases, proteases e mananases.
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Métodos enzimáticos de rompimento de células –
VANTAGENS:
Facilidade no controle de pH
Facilidade no controle de temperatura
Baixo investimento de capital
Alta especificidade para degradação da parede celular
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Métodos enzimáticos de rompimento de células –
DESVANTAGENS:
Alto custo das enzimas
Variação da eficiência da lise enzimática 
com o estado fisiológico do microrganismo
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Métodos mecânicos de rompimento de células
• São os métodos de rompimento mais utilizados
industrialmente.
Fatores determinantes são: Equipamentos utilizados:
•
Tamanho e a forma das 
células
Estrutura da parede celular
Homogeneizador de alta 
pressão
Moinhos de bolas
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Métodos mecânicos de rompimento de células –
HOMOGENEIZADOR DE ALTA PRESSÃO
• Pistões = aplicam alta pressão à suspensão celular;
• Forçam a passagem da suspensão por um orifício estreito;
• A qual colidem com uma superfície em uma câmara de
baixa pressão.
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Métodos mecânicos de rompimento de células –
HOMOGENEIZADOR DE ALTA PRESSÃO
• A queda instantânea de
pressão associada ao
impacto: provoca o efetivo
rompimento celular sem
danificar proteínas.
• Células maiores rompem-se
mais facilmente.
• Pressões mais elevadas 
aumentam a eficiência do 
processo.
ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
MICROBIANAS
Métodos mecânicos de rompimento de células – MOINHO 
DE BOLAS
• Câmara cilíndrica fechada, vertical ou
horizontal.
• O eixo gira em alta rotação com
esferas (inox, vidro, cerâmica).
• Rompimento se dá por força de
cisalhamento.
• Carga de esferas (80-85% câmara
horizontal e 50-60% câmara vertical).
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
PRECIPITAÇÃO
• Precipitação de produtos microbianos em meios aquosos é
um dos métodos mais tradicionais de purificação e
concentração.
• Aplicado na purificação de proteínas.
• É um método de concentração, pois reduz o volume inicial.
• As proteínas precipitadas têm sua estrutura tridimensional
modificada. A aplicação desse método só é viável quando à
adequada conformação da proteína é recuperada após a
precipitação.
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
PRECIPITAÇÃO – “SALTING OUT”
• Precipitação de proteínas em altas concentrações
salinas (1,5 a 3,0 M).
• Reduz a disponibilidade de água criando condições
para a precipitação da proteína.
• Os sais mais utilizados são os que apresentam
elevada solubilidade: citrato de sódio, sulfato de
sódio e sulfato de amônio.
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
ULTRAFILTRAÇÃO
Transporte de soluções através de membranas com poros 
de 0,001 a 0,1 μm de diâmetro.
São usadas para concentrar macromoléculas de proteínas e 
polissacarídeos.
O tamanho dos poros não são uniformes e tem distribuição 
normal ao redor do tamanho médio do poro.
“Diâmetro nominal de corte” é a melhor forma de expressar 
o tamanho do poro da membrana.
Tamanho do poro deve ser 20% menor que o tamanho da 
moléculaalvo.
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
ULTRAFILTRAÇÃO – VANTAGENS:
Separar bioprodutos de caldos fermentados 
diluídos.
Promover a concentração de compostos a 
baixas temperaturas e pressão.
Possibilitar a retirada de moléculas pequenas.
Manter o pH do meio constante.
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
ULTRAFILTRAÇÃO – DESVANTAGENS:
Resolução da técnica é baixa.
As moléculas lineares passam pelos poros
mais facilmente que as globulares, uma vez
que a distribuição dos poros não é uniforme.
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
EXTRAÇÃO EM SISTEMAS DE DUAS FASES
Método utilizado a mais de 60 anos para extração de
antibióticos e ácidos orgânicos.
Duas fases líquidas imiscíveis, uma aquosa e um
solvente.
Usado para proteínas altamente sensíveis a
desnaturação.
Molécula alvo e as impurezas são separadas por
diferença de solubilidade entre as fases.
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
EXTRAÇÃO EM SISTEMAS DE DUAS FASES
Sistemas mais comuns polietilenoglicol (PEG)/sal, pois:
- Apresentam rápida separação das fases;
- Baixo custo;
- Maior seletividade na separação das moléculas.
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
EXTRAÇÃO EM SISTEMAS DE DUAS FASES - VANTAGENS
• Operação contínua, em larga
escala e à temperatura ambiente.
• Proteínas em meios a polímeros
ou sais que as protegem da
desnaturação.
• Possibilidade de eliminação de
algumas etapas do processo de
purificação para moléculas
intracelulares.
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
CROMATOGRAFIA
• Os solutos de um meio líquido (proteínas, peptídeos,
anticorpos) são adsorvidos ou retidos em um leito de
material poroso.
• A posterior remoção dos solutos por ação de uma
fase líquida, resulta na separação das diferentes
moléculas.
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
CROMATOGRAFIA
• FASE ESTACIONÁRIA: empacotada em uma coluna,
constituída por um polímero, partículas esféricas de
aproximadamente 100 μm.
• FASE MÓVEL: líquida, a qual é bombeada através da
fase estacionária.
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
CROMATOGRAFIA
• CROMATOGRAMA: é um gráfico que representa a
concentração das moléculas no eluente que sai da
coluna.
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
CROMATOGRAFIA – GEL DE FILTRAÇÃO
• As biomoléculas são retidas nos
poros de uma matriz de
porosidade definida em função
do seu volume.
• Moléculas com volume
excedente ao volume do poro
são expulsas da coluna.
• Moléculas pequenas penetram
nos poros e em seguida são
arrastadas pelo eluente.
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
CROMATOGRAFIA – TROCA IÔNICA
• Mais frequentemente utilizada.
• Processo de separação pela
afinidade dos componentes de
uma amostra com sítios iônicos
em uma matriz sólida.
• A fase estacionária,
eletricamente carregada, tem
capacidade de reter solutos que
estão na fase móvel e
apresentam cargas opostas.
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
CROMATOGRAFIA – TROCA IÔNICA
• Os solutos podem ser eluídos por deslocamento com
outros íons, com a mesma carga da proteína adsorvida,
porém com maior grau de interação com a fase
estacionária.
• Cromatografia de troca iônica é processada descontínua e
em três etapas: carga, eluição da amostra e regeneração da
fase sólida.
• Na ampliação da escala, mantém o comprimento da
coluna, porém aumenta-se seu diâmetro.
TRATAMENTOS FINAIS
LIOFILIZAÇÃO
• Processo de remoção do solvente = tipicamente água
= por sublimação.
Para sublimação da água livre
Submetido a baixa pressão
Congelado
Material
TRATAMENTOS FINAIS
LIOFILIZAÇÃO
• Materiais liofilizados = apresentam-se na forma de
pó.
• Apresentam-se estáveis por muito mais tempo,
quando comparado com conservação em solução
aquosa.
• Porém se a liofilização não for corretamente
realizada pode provocar a desnaturação das
proteínas (materiais proteícos).
TRATAMENTOS FINAIS
CRISTALIZAÇÃO
• Permite a estocagem estável de bioprodutos.
• Cristalização é o processo de agregação de cristais de
moléculas presentes em soluções homogêneas
supersaturadas.
TRATAMENTOS FINAIS
CRISTALIZAÇÃO
• Utilizada para enzimas e proteínas.
• É importante destacar que algumas proteínas podem
ser desnaturadas com a cristalização.
• Compostos cristalizados são estáveis.
PROCESSO INTEGRADO DE 
PURIFICAÇÃO
• As características do produto e das principais
impurezas é fundamental para o sucesso da seleção
das operações unitárias de purificação.
• Algumas propriedades físico-químicas norteiam a
escolha das operações.
• A modificação das estruturas também é um recurso
importante para o aumento da resolução de
determinadas operações e consequente redução do
número de etapas no processo.
PROCESSO INTEGRADO DE 
PURIFICAÇÃO
• O sucessos técnico e econômico do processo está
relacionado à seleção adequada de técnicas e da
ordem de aplicação das mesmas.
Aplicação de técnicas de alta resolução nas etapas finais do processo.
Remoção de impurezas presentes em maior concentração nas etapas 
iniciais
Escolha o processo baseado nas diferenças das propriedades físico-
químicas apresentadas