INTRODUCAO AO DNA RECOMBINANTE FARM 2015

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INTRODUÇÃO À TECNOLOGIA 
DO DNA RECOMBINANTE 
Disciplina: Biologia Molecular 
Profa. Dra. Raquel Alves dos Santos 
extração Com isolar o fragmento de 
interesse ? 
Numa população de DNA extraído de uma célula, existe 
uma mistura complexa de moléculas 
A manipulação do material genético 
depende: 
Da compreensão da estrutura e funcionamento dos genomas; 
De modelos experimentais adequados; 
Dos avanços tecnológicos (engenharia; informática). 
•1972 – Produção da primeira molécula de DNA 
recombinante 
Molécula de DNA recombinante : 
 
DNA formado pela combinação de segmentos de 
DNA de origens diferentes 
Possibilitou a clonagem 
Processo que permite o aumento 
seletivo do número de cópias de 
um determinado gene 
Principais passos da 
clonagem 
Organização do genoma 
bacteriano; 
Formas “reprodutivas” (de 
transferência genética) das 
bactérias; 
Propriedades adaptativas 
das bactérias; 
Presença de genes de resistência a antibióticos 
Primeiro passo: como o DNA é cortado 
Enzimas de restrição : endonucleases que reconhecem 
e cortam ligações internas do DNA 
Reconhecem sequências de bases específicas do DNA 
Origem : bactérias : sistema restrição - modificação 
Confere proteção contra DNAs 
estranhos (bacteriófagos) 
Sistema restrição-modificação em bactérias 
 Uma enzima de restrição que reconhece e corta uma 
sequência particular do DNA, se esta não estiver metilada; 
 Uma metiltransferase que reconhece a mesma sequência na 
bactéria e metila bases particulares, modificando-a. 
Virtualmente todas as bactérias têm sistema 
restrição/modificação 
Seq. Reconhecimento Enzimas 
AA/CGTT Acl I Arthrobacter luteus 
A/AGCTT Hind III Haemophilus influenzae 
A/CATGT Pci I Planococcus citreus 
A/CCGGT Age I Agrobacterium gelatinovorum 
ACCTGC(4/8) BspM I Bacillus sphaericas 
A/CGCGT Mlu I Micrococcus luteus 
A/GATCT Bgl II Bacillus globigii 
AG/CT Alu I Arthrobacter luteus 
AGG/CCT Stu I Streptomyces tubercidicus 
AGT/ACT Sca I Streptomyces caespitosus 
•Reconhecem sequências específicas do DNA, geralmente 
palindrômicas 
5’-TGGCCA-3’ 
3’-ACCGGT-5’ 
BalI 
5’-TGG CCA-3’ 
3’-ACC GGT-5’ 
Extremidades não-
coesivas (“blunt”) 
Clivagem 
Extremidades coesivas 
Ponto de digestão no eixo 
de simetria 
Ponto de digestão fora do 
eixo de simetria 
Maior parte das enzimas tipo 2 
reconhecem sequências palindrômicas 
de 4-8 pb. 
Enzima de restrição e o DNA recombinante 
Vetor recombinante 
Uma DNA ligase sela a união dos segmentos 
Pontes H : Ocorrem 
espontaneamente 
Mais usada : T4 DNA ligase 
Requer ATP 
Segundo passo: o DNA é inserido num vetor 
Vetores : moléculas de DNA que se reproduzem 
autonomamente em uma célula hospedeira, no qual um 
segmento de DNA (inserto) pode ser inserido 
Alguns tipos de vetores: 
 
 Plasmídeos 
 Bacteriófagos 
 Cromossomos artificiais de bactérias 
Capacidade dos insertos dos vetores frequentemente 
utilizados em clonagem molecular 
100 a 300 E. coli Cromossomo artificial derivado do 
Bacteriófago P1- PACs 
100 a 2.000 levedura Cromossomo artificial de levedura - YACs 
50 a 300 E. coli Cromossomo bacteriano artificial - BACs 
80 a 100 E coli Bacteriófago P1 
35 a 45 E coli Cosmídeo 
10 a 20 E.coli 
 
Bacteriofago lambda 
0,1 a 8 E. coli Plasmídeo 
Capacidade de 
clonagem (kb) 
Sistema 
hospedeiro 
Sistema Vetor 
Plasmídeos 
Moléculas circulares de DNA que se duplicam de modo 
independente do DNA cromossomal bacteriano 
Plasmídeos naturais são modificados para serem mais 
eficientes na produção de DNA recombinante 
Insertos de até 10 kb, 
frequentemente 
menores do que 5 kb 
O bacteriófago lambda como vetor 
BACs (cromossomos artificiais de bactérias) 
Fator F : plasmídeo de 
fertilidade em E.coli 
 
Contém genes que 
promovem a distribuição 
igualitária dos plasmídeos 
após a divisão bacteriana 
Insertos de mais de 300 kb 
YACs (cromossomos artificiais de levedura) 
São combinadas 4 sequências 
curtas : 
2 telômeros 
1 centrômero 
1 elemento ARS (replicon) 
1 inserto de ate 2 Mb 
Vetores de expressão 
Construídos para que haja a expressão do inserto 
São usados sistemas de acordo com : 
•Tipo de expressão do produto : RNA (produção de sondas, RNA 
antisenso); em outros casos, é necessária a expressão proteica. 
•Tipo de ambiente : se o vetor será expresso in vitro ou em um 
sistema celular 
•Proposta do sistema de expressão : se é somente para 
investigar a expressão, ou se pretende-se produzir grandes 
quantidades da proteína 
•Seleção de recombinantes 
•O vetor contém um gene marcador, o qual complementa 
uma deficiência da célula hospedeira : 
Gene de resistência a antibiótico : ampicilina, tetraciclina, 
cloranfenicol 
ou 
Complementação com gene da -galactosidase : a enzima 
produzida pelo vetor age sobre uma substância incolor (X-
gal) tornando-a azul 
•1 – A bactéria contém o vetor ? 
•Bactéria sensível à ampicilina 
•Vetor com gene 
de resistência a 
amp •Bactéria adquire 
resistência a amp 
•Bactéria sem gene da 
-galactosidase ativa 
•Bactéria capaz 
de metabolisar X-
gal 
•Vetor com 
gene lacZ 
•2 – O vetor contém o inserto ? 
• Um gene marcador é inserido no sítio polylinker. Ex. : -galactosidase 
• A inserção do fragmento causa disrupção do gene 
•O vetor com o inserto não expressa o gene marcador 
•Células com vetor, sem 
o inserto 
•Lac Z íntegro 
•-galactosidase ativa 
converte X-gal 
•Célula azul 
•Células com vetor, com 
o inserto 
•Lac Z é rompido 
•Sem produção de -
galactosidase 
•X-gal não é convertido 
•Célula branca 
•Sítio poly-
linker 
•Gene da -
galactosidase 
•Gene de resistência a 
kanamicina 
•Indica se a bactéria tem o vetor 
•Indica se o 
vetor tem o 
inserto 
•O gene lacZ foi 
rompido-gene 
inativado 
•O gene 
ampR está 
íntegro – 
pode conferir 
resistência à 
ampicilina 
Caracterização dos clones : qual a identidade do inserto ? 
Mapeamento de restrição 
DNA é clivado com uma ou mais enzimas de restrição 
Os fragmentos são separados em gel de agarose 
Ex. : digestão de um fragmento de 7,5 kb com HindI e Sma I 
1 kb 
2 kb 
M 
3 kb 
4 kb 
5 kb 
HindI SmaI Hind 
Sma 
2,5 5 
2 5,5 
2,5 5 
2 5,5 
2,5 
5 5,5 
2 
1 kb 
2 kb 
M 
3 kb 
4 kb 
5 kb 
HindI SmaI 
Digestão dupla 
HindI+ 
SmaI 
2 
2,5 
3 
2,5 2 3 
Hind Sma 
Hind 
Sma 
2 5,5 
2,5 5 
Se dois fragmentos 
independentes apresentam 
padrões de bandas similares, 
provavelmente contém a 
mesma seqüência ou são 
relacionados