Biologia Molecular- Técnicas de RAPD

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA FRONTEIRA SUL
CAMPUS REALEZA
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
ALINE BIAZOTTO PEREIRA DA SILVA
ELAINE CAROLINE DE OLIVEIRA
TRABALHO DE BIOLOGIA MOLECULAR SOBRE TÉCNICAS DE PCR E SEUS MARCADORES
O USO DE MARCADORES MOLECULARES DE RAPD COMO POTENCIAL INFORMATIVO PARA A DISTINÇÃO ENTRE JAVALI Sus scrofa scrofa, O SUÍNO DOMÉSTICO Sus scrofa domesticus E SEUS HÍBRIDOS
INTRODUÇÃO E OBJETIVO:
As técnicas de PCR começaram a ser utilizadas a partir dos anos 90 e elas utilizam de fragmentos do DNA especifico e os amplificam. Esse DNA pode ser retirado de qualquer tecido ou excretas do indivíduo e, na medicina veterinária pode auxiliar na identificação de vírus, bactérias, protozoários, doenças infecciosas e para teste de progênie. É realizada com iniciadores de sequência arbitrária com um reduzido número de nucleotídeos (aproximadamente 10), com temperatura de anelamento abaixo do ideal, que é especifica para cada par de primers, dessa forma, cada primer se encaixa nas respectivas sequencias complementares à região alvo da amplificação. Depende do tamanho do primer e sua sequência de nucleotídeos. A técnica de RAPD permite que o iniciador se anule em alguns locos, gerando diversas bandas. A RAPD não necessita do conhecimento de toda a sequência do DNA. Essa técnica detecta polimorfismos em sequências de nucleotídeos em diferentes organismos isolados, sem a necessidade de informação prévia sobre a sequência analisada.
O trabalho teve como objetivo avaliar o potencial informativo das espécies de javali, suíno doméstico e seus híbridos a partir das técnicas de PCR com marcadores moleculares RAPD (DNA polimórfico amplificado aleatoriamente). 
MATERIAIS E MÉTODOS:
Utilizaram-se ao todo 27 animais, sendo esses 16 javalis metade originária do Canadá e metade da França e 11 suínos domésticos, 4 da raça Large White e 7 são cruzamentos da raça Landrace e Large White originários do setor de suinocultura da fazenda Experimental Lageado, UNESP Botucatu.
Foram utilizadas amostras de 5ml de sangue total colhidas da jugular e homogeneizadas em EDTA (anticoagulante) e mantidas a 4°C até o momento da extração do DNA. A extração fora feita com o kit específico para sangue. Regiões aleatórias do DNA foram amplificadas pela técnica de PCR em um termociclador.
“A reação da amplificação foi dirigida por 11 primers únicos em 11 reações independentes e as bandas foram obtidas através de primers comerciais, OPG2, OPG12, OPG13, OPG 16, OPR4, OPR7, OPR8, OPR9, OPX1, OPX2 e OPX5 da OPERON. Após a amplificação, os fragmentos de DNA foram separados em gel de agarose de baixo ponto de fusão a 2%, em um sistema de eletroforese horizontal, diferença de potencial de cerca de 5,5 V/cm, por 2 horas. Os fragmentos de DNA amplificados foram corados por meio de brometo de etídio e o DNA foi visualizado por meio da fluorescência do brometo de etídio, quando exposto à luz ultravioleta.
Os marcadores RAPD foram analisados utilizando o programa TREECON for Windows, pela presença ou ausência de bandas com polimorfismo no gel, por meio de coeficiente de King e o método de agrupamento UPMGA. ” (GIMENEZ, 2005);
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
Através dos primers retirados do DNA dos 27 animais geraram 107 bandas, sendo 75 polimórficas (70,1%) e 32 monomórficas (29,9%). Com o primer OPX5 não obtiveram bandas.
O primer OPX2 gerou o menor polimorfismo (33,4%) e o primer OPG16 obteve o maior polimorfismo (83,4%). A média das bandas geradas pelos primers foi, aproximadamente, 10,7.
A análise dos 27 animais, permitiu dividi-los em 3 grupos: G1, G2 e G3. O grupo G1 possui grande homologia com G2, sendo G1 formado por 11 suínos domésticos e G2 por 4 javalis franceses e 2 do Canadá . E o grupo G3 inclui 5 javalis do Canadá e 2 da França e se mostrou distinto dos anteriores.
Esses animais, por serem de diferentes locais, comprovam que não houve cruzamento entre eles, portanto, a variação observada através dos marcadores utilizados é a comprovação da variabilidade genética de cada espécie.
CONCLUSÃO:
Através dos resultados obtidos, confirma-se o potencial informativo pela técnica RAPD em detectar a variabilidade intraespecífica no gênero Sus (suínos) através do padrão de bandas isoladas geradas na técnica. Isso nos permite distinguir a diferença entre javalis, suínos domésticos e híbridos.
DISCUSSÃO:
Por que a técnica de RAPD é adequada para esse tipo de pesquisa?
Porque ela distinguir e diferenciar espécies próximas e graus de polimorfismo entre gêneros, espécies, subespécies e raças.
Em questões de biossegurança nas pesquisas, por que a PCR é utilizada?
Porque não necessita da realização da inoculação e cultura de microrganismos, como nos métodos clássicos utilizados em diversos laboratórios. Ela analisa fragmentos de DNA e os amplifica.
REALEZA
2016