Espectrofotometria - biofisica

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Introdução à Biofísica
Métodos biofísico de análise 
Estuda os fenômenos físico e físico-químicos relacionados a eventos biológicos;
Tem metodologia própria o que justifica o seu estudo como disciplina distinta:
Estudam-se os fenômenos moleculares, físicos (ex: movimento) e físico-químico (ex: ph do sangue) relacionados as atividades biológicas promovendo a interação entre a farmacologia, fisiologia, fisiopatologia clinica e terapêutica.
Medida
É a descrição de algo em termos de valores numéricos (densidade)
É a determinação da magnitude de alguma propriedade (viscosidade)
Propriedades 
São características e atributos :
Quantitativas - quando podem ser medidas
Qualitativas - quando não for possível ser medidas
Sistema métrico
É uma medida especificamente formulada para ser usada com notação decimal.
Consiste: unidade primária para cada propriedade quantitativa e um conjunto de prefixos. 
Cada prefixo indica um fator que multiplicado pela unidade primária produzirá maiores ou menores unidades de uma propriedades
O fator de um prefixo é normalmente exponencial do número 10.
Ex.: 1 kg = 1.000 g = 103 
 1 ml = 1/1000 L
Propriedade básica
Símbolo da propriedade
Unidade básica
Símbolo da unidade básica
Comprimento
l
Metro
M
Massa
m
Quilograma
kg
Tempo
t
Segundo
S
Corrente elétrica
I
Ampère
A
Temperatura
T
Graus Kelvin
K
Intensidade luminosa
Iv
Candela
cd
Quantidade de substância
n
Mol
mol
Quantidade catalítica
z
Katal
kat
Propriedades do SI
Métodos físicos usados para 
avaliar o meio biológico
Tipos de análise correntes
Clássicos
GRAVIMETRIA (massa – g/g), 
VOLUMETRIA (volume de uma solução padrão – titulação)
Década de 1950 - Métodos de análise baseados em equipamentos eletrônicos
ESPECTROSCOPIA – espectro característicos de átomos , moléculas e substâncias;
CROMATOGRAFIA – separação de substâncias baseada na afinidade entre duas fases (móvel e estacionária);
POTENCIOMETRIA – baseada em potenciais elétricos, concentrações, atividade, etc.; 
ELETROFORESE – carga elétrica de substâncias associada ao tamanho e forma molecular;
ANÁLISE TERMOGRAVIMETRIA – perda de massa e eventos físico-químico, etc.
POLARIMETRIA – luz polarizada;
REFRATOMETRIA – índice de refração.
Agrupamentos dos métodos 
Óticos
Espectrofotometria 
Absorção – absorção atômica, UV, VIS e IV
Emissão – fotometria na chama, fluorimetria, espectrometria de emissão.
Polarimetria e refratometria 
Elétricos – voltametria, coulometria, potenciometria, condutimetria e eletroforético
Cromatográficos – gasosa, liquida, iônica, filtração em gel (CLAE), papel e camada delgada.
Para identificar e quantificar uma espécies química 
Separação da amostra 
Grau de uniformidade do material para análise
Seleção da quantidade
Separação dos componentes que possam interferir na análise
Escolha do método de análise
Simplicidade com sensibilidade e precisão
Ideia de precisão e exatidão (ex: tiro ao alvo)
*para identificar o meio biológico se utiliza métodos físicos (usados para quantificar o meio)
Espectrofometria
Introdução
Capacidade de espécies químicas de absorver ou emitir radiações eletromagnética.
Caracterizar uma amostra (moléculas ou átomos)quanto a concentração e identificação
Por que usar a espectrofotometria ?
Diferentes modos de interação da energia radiante com o meio material;
Disponibilidade de equipamentos mais precisos no mercado;
Vantagens do próprio método – sensibilidade, precisão e rapidez.
Não tem caráter destrutivo
Radiações eletromagnética
Componente elétrico 
Componente magnético (na radiação com o meio material, o meio magnético não se manifesta)
Comportamento ondulatório - propriedade de onda 
Comportamento corpuscular - propriedade de partícula – fótons
Comportamento ondulatório
Comprimento de onda () – Ao, nm, , cm, m
Freqüência () – ciclos.s-1 (Hz) (nº de ciclos por seg. que passa por um ponto)
Amplitude, nº de ondas, etc.
Comportamento corpuscular - fótons ou pacotes de energia 
E = hν = h(c/λ)
Espectro radiante: 
Interação da radiação com o meio material
M + h ---------> M*
Espectro de absorção
Incidir radiações de vários comprimentos de onda em um meio material e observar em qual deles ocorre maior absorção da radiação eletromagnética.
Absorciometria
a energia radiante monocromática transmitida (I) em um meio material homogêneo é proporcional à energia radiante incidente (Io)” (Bouguer)
a energia radiante monocromática transmitida (I) decresce exponencialmente quando o caminho ótico (b) aumenta em progressão aritmética” (Bouguer, Lambert);
a intensidade de um feixe de luz monocromática que atravessa uma solução corada de determinada concentração (C), decresce exponencialmente à medida que a espessura (b) ou a concentração (C) da solução aumenta aritmeticamente (Lambert-beer) 
I = Io x 10-kbc  I/Io (T) = 10-kbc  log (I/Io) = - kbc
log (Io/I) = kbc
Transmitância e absorbância: 
T = I/Io  T = 10-kbc  log T = -kbc 
log (1/T) = kbc  -log T = kbc
A = - log T  A = kbc
A = kbc = -log T = -log (I/Io) = log (Io/I)
 
Expressão de K:
absortividade (a) – C (g/l) e b (cm)
absortividade molar (am) – C (mol/l) e b (cm)
Curva de calibração
Abs. X Conc. (soluções padrões)
Tabela 1 – Sistema reacional 
Tubos
Sol.Padrão
(ml)
H2O
(ml)
Conc. (mg/ml)
T (%)
Abs.
Branco
---
5
---
100
0,0
1
1
4
2
2
3
3
3
2
4
4
1
5
5
---
Linearidade e desvio da lei de Lambert- Beer
Tabela 2 – Relações de cores do espectro visível