Aula 2 _ Métodos Biofísicos de Estudos

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BIOFÍSICA 
Métodos Biofísicos de Estudos
Prof.: Lucas R. Nogueira.
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INTRODUÇÃO
Soluções Biológicas são multicomponentais
	Águas + Vários componentes
Os métodos biofísicos de estudos permitem estudar estes componentes:
	Qualitativamente e Quantitativamente;
	Permite separar;
	Permite Identificar;
	Permite estudar as propriedades estruturais dos componentes;
	Permite estudar suas funções.
Os métodos são: 
ESPECTROFOTOMETRIA
CROMATOGRAFIA
ELETROFORESE
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Consiste em usar a radiação eletromagnética (Luz) para inspecionar sistemas biológicos – soluções.
Procedimento básico:
	
A diferença: “Luz que foi absorvido e luz que foi transmitida, oferece informações sobre a qualidade e a quantidade dos componentes do sistema”
A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho.
ESPECTROFOTOMETRIA
Luz
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectro usado: UV – Visível – IV
A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao infravermelho no espectro da radiação eletromagnética.
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ESPECTROFOTOMETRIA
Um espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução.
O espectrofotômetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda.
Diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, desta forma, é possível identificar substâncias com base no seu espectro.
Substâncias verdes (soluções) deixam passar (refletem) a cor nesse comprimento de onda, absorvendo mais a luz na região do vermelho.
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ESPECTROFOTOMETRIA
Luz Monocromática (LM):
Luz de um único comprimento de onda
É a luz usada no Espectrofotômetro
Ela é usada por duas razões:
Permite identificar os compostos, dá sensibilidade. Cada substância absorve um único comprimento de onda (luz), por isso, para se saber qual substância estamos analisando devemos passar um único comprimento de onda.
A quantidade de luz absorvida permite estabelecer a concentração da solução.
Tipos de espectrofotômetros:
Absorção
Emissão
Fluorescência e Absorção atômica
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Absorção
Instrumentos e equipamentos:
A = Lâmpada
B = Prisma
C = Seletor
D = Cubeta
F = Fotocélula
G = Galvanômetro
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Absorção
Modo de operar o Espectro:
Zerar
Padronizar
Passar o desconhecido
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Absorção
Uso do espectro:
Curva de Absorção espectral
Determinação da Concentração da Solução
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Absorção
Curva de Absorção espectral:
Identificar substâncias
Identificar grupamentos químicos
Indicar a pureza das substâncias
Indicar o comprimento de onda para dosar as substâncias
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Absorção
Determinação da Concentração de substâncias:
Princípio de absorção da Luz:
A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada:
Quando o trajeto óptico é constante, a absorção depende da concentração (Lei de Beer)
A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através das amostras: 
Quando a concentração da substância é constante, a absorção depende do comprimento do trajeto óptico (Lei de Lambert)
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Absorção
Determinação da Concentração de substâncias:
Lei de Beer
Lei de Lambert
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Absorção
Determinação da Concentração de substâncias:
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Absorção
Curva de calibração:
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Emissão
Neste o sistema biológico é excitado e emite luz
A Luz é característica das substâncias emissoras
FOTOMETRIA DE CHAMA
Usado para cátions
Quando aquecidos emitem luzes características
Muito usado para determinação do Na+, K+ e Ca+2
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ESPECTROFOTOMETRIA
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ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetros de Emissão
FLUORIMETRIA
A excitação é feita com luz UV
Neste tipo de excitação os compostos orgânicos não são destruídos
Serve para determinar vitaminas
Neurotransmissores
Substâncias fluorescentes
Fotometria de Absorção Atômica
Baseia-se no fato que os metais absorvem os mesmos comprimentos de onda que emitem
A lâmpada emissora é do metal que deseja-se analisar
A substância analisada é vaporizada na cubeta.
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ESPECTROFOTOMETRIA
Fluorímetro
Fotometria de Absorção atômica
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CROMATOGRAFIA
Permite separa os componentes de um sistema biológico.
Consiste em movimentar o sistema em condições apropriadas, e separar espacialmente os componentes
A separação é feita em um sistema bifásico
Sólido-Líquido (Cromatografia Líquida)
Sólido-Gasoso (Cromatografia Gasosa)
A fase sólida é chamada de fase fixa, suporte ou matriz
A outra fase é chamada de fase móvel, solvente ou eluente
A solução a ser separa corre na fase móvel, e os componentes são retardados seletivamente na fase fixa
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CROMATOGRAFIA - Coluna
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CROMATOGRAFIA – Papel ou Placa
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CROMATOGRAFIA
As cromatografias podem ser feitas de vários modos;
Coluna
Placa
COLUNA
Fase fixa é empilha e bem umedecida com o solvente
PLACA
A fase fixa forma uma fina camada ou usa-se um papel
Classificação (força que participa do processo)
Adsorção, Partição, Filtração ou Exclusão, Troca Iônica e Afinidade
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CROMATOGRAFIA
Adsorção:
Adsorção é a adesão de moléculas de um fluido (o adsorvido) a uma superfície sólida (o adsorvente); o grau de adsorção depende da temperatura, da pressão e da área da superfície - os sólidos porosos como o carvão são ótimos adsorventes.
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CROMATOGRAFIA
Partição:
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CROMATOGRAFIA
Filtração ou Exclusão:
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CROMATOGRAFIA
Troca Iônica:
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CROMATOGRAFIA
Troca Iônica:
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CROMATOGRAFIA
Afinidade:
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CROMATOGRAFIA
Afinidade:
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Consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico.
Princípio do método:
ELETROFORESE
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A eletroforese permite separar qualitativamente e quantitativamente as partículas que possuem cargas
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE
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Fatores que condicionam a migração:
Tamanho das partículas
pH do meio
pI ou pK da substância
pH < pI  +
pH = pI  0
pH > pI  -
Quanto maior é a diferença pH > pI ou pH < pI, maior é o número de cargas negativas ou positivas geradas no composto
ELETROFORESE
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Aplicações:
Estudo clínico do plasma e de líquidos corporais;
Separação de misturas complexas de proteínas, ácidos nucléicos e aminoácidos;
Identificação de componentes;
Determinação da pureza de substâncias;
Determinação do pI;
Determinação da massa molecular de substâncias.
ELETROFORESE
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