Métodos Experimentais Para o Estudo da Dor

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Métodos Experimentais Para o Estudo da Dor
 
A dor pode ser descrita como uma “experiência sensorial, com tonalidade afetiva desagradável, oposta ao 
prazer, induzida por estímulos (nocivos/nociceptivos) mecânicos, térmicos, químicos, elétricos ou 
fisiopatológicos”. A esta sensação (dor/nocicepção) estão associadas respostas neurovegetativas ou 
comportamentais, que são mais intensas ou mais rápidas quando o tecido está inflamado. Considerando 
aspectos comportamentais como reações no sentido de evitar estímulos desagradáveis, pode-se dizer, 
também, que a dor é um sintoma com finalidade protetora, que “alerta” a presença de ameaças, 
protegendo a integridade física do organismo no ambiente e defendendo-o contra agentes infecciosos, 
“avisando” a ocorrência de distúrbios patológicos orgânicos por meio dos sistemas imunes inato e 
adaptativo. 
 
Entretanto, a definição do conceito “dor” não é tão fácil, uma vez que componentes subjetivos próprios 
do indivíduo podem alterar a sensação produzida por estímulos nocivos. Desta forma, é interessante 
relacioná-la às vias nervosas especializadas em detectar a presença de estímulos nocivos, ou que podem 
se tornar nocivos caso permaneçam. Tais vias são conhecidas como vias nociceptivas, e são compostas 
por fibras neuronais que são ativadas por estimulação intensa. 
 
Essa discussão surgiu do fato de que muitos dos experimentos realizados com metodologias que 
empregam estímulos dolorosos são realizados em animais, os quais apresentam reações 
comportamentais compatíveis com a sensação de dor, porém, uma vez que não é possível determinar 
objetivamente se a sensação apresentada é realmente dor – já que o animal não pode se comunicar -, é 
preferível classificá-la como sendo resultado da ativação das vias nociceptivas. Portanto, podemos 
denominar tais reações em animais experimentais como nocicepção. 
 
Considerando que a investigação científica da hipernocicepção e nocicepção de origem inflamatória pode 
ser realizada seguindo vários protocolos, nesta seção de nosso Portal DOL apresentamos uma breve 
descrição dos métodos mais utilizados em laboratórios para avaliação de comportamentos apresentados 
por animais submetidos à experiência dolorosa (ou nociceptiva, como explicado acima). É importante 
salientar que a utilização destes testes deve estar sempre condicionada à submissão de seu protocolo ao 
Comitê de Ética de cada instituição, para que a metodologia seja analisada de acordo com normas 
internacionais de experimentação animal, e, sua realização, aprovada. Desta forma, todos os ensaios 
mostrados abaixo foram previamente aprovados pela CETEA - Comissão de Ética em Experimentação 
Animal da FMRP, em estudos relacionados a trabalhos científicos do grupo de dor e inflamação do 
Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
 
São apresentados dois tipos de testes: os que avaliam a ação de drogas sobre comportamentos 
indicativos de dor manifesta (ou nocicepção manisfesta), nos quais o estímulo utilizado causa, por si só, a 
ativação das vias nociceptivas, induzindo o comportamento compatível com dor (como nos casos do teste 
de formalina ou de contorções abdominais com ácido acético), e os modelos de avaliação de 
hipernocicepção, nos quais é feita a administração de drogas que induzem a sensibilização das fibras 
neuronais nociceptivas. Nestes últimos, são avaliados parâmetros que indiquem e presença de 
fenômenos como a hipernocicepção ou alodinia, ou seja, nos quais ocorre diminuição do limiar de 
tolerância à estimulação de caráter mecânico, térmico ou químico. 
 
Ainda, ao final de cada item, apresentamos referências bibliográficas de trabalhos que abordam tais 
metodologias. 
1. Ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético 0,1 N 
1.1 - Animais
Camundongos ou ratos.
 
1.2 - Tipo de teste
Nocicepção manifesta por injeção de agente algésico.
 
1.3 - Detalhamento do teste
pós a injeção intraperitoneal (ip) de um agente nociceptivo em ratos ou camundongos, observa-se 
respostas que consistem em uma seqüência de contorções e extensões do abdômen, algumas vezes 
acompanhada por torções do tronco e extensão dos membros posteriores do animal. Este 
comportamento foi denominado de contorção abdominal por Whittle em 1964. 
 
Para o ensaio são utilizados camundongos suíços de ambos os sexos, com peso entre 18 e 25 gramas. 
Ratos de pouca idade (100 g) também podem ser submetidos ao teste. Os animais são mantidos em 
jejum por um período de 8 horas. As substâncias devem ser administradas preferencialmente por via 
oral. Trinta minutos após a administração das drogas a serem testadas, é feita a injeção do estímulo 
algésico, ou seja, injeta-se ácido acético 0,1N na cavidade peritoneal dos animais (0,1 ml/10 g de peso 
do animal). Dez minutos após administração do ácido acético inicia-se a contagem das contorções, 
durante vinte minutos. 
 
1.4 - Bibliografia
• COOLIER, H.O.J; et al. (1968) The abdominal constriction response and its suppression by 
analgesic drugs in the mouse. Br. J. Pharmac. Chemother. 32, 295-310;
• WHITTLE, B.A. (1964) The use of changes in capillary permeability in mice to distinguish between 
narcotic and non narcotic analgesics. Br. J. Pharmac. Chemother., 22, 246-253. 
2. Teste da formalina 
2.1 - Animais
Camundongos ou ratos.
 
2.2 - Tipo de teste
Nocicepção manifesta por injeção de 
agente algésico.
 
2.3 - Detalhamento do teste
2.4
Camundongos suíços de ambos os sexos 
deixados em jejum por um período de 8 
horas, ou ratos com peso entre 100 e 
200 g, recebem administração subplantar de 20 µl de uma solução de formalina 2,5% na 
pata traseira. Uma hora antes da administração da formalina drogas a serem testadas são 
administradas por via oral na dose de 100 µmol/kg numa suspensão com goma arábica 5%, 
podendo ser administradas na pata dos animais em casos nos quais têm-se a intenção de 
observar seu efeito local. O tempo que o animal lambe, sacode (comportamento conhecido 
como “flinch”) ou morde a pata traseira é então cronometrado. São observadas duas fases 
distintas. A primeira fase (0-5 minutos pós-injeção) é chamada de fase neurogênica, na qual 
ocorre a ativação direta dos nociceptores locais pela formalina, e a segunda (15-30 minutos 
após a injeção) é chamada de fase inflamatória, na qual o comportamento observado é 
resultante da ação de mediadores inflamatórios liberados pelo estímulo. 
 
Variações do teste de formalina têm sido utilizadas na pata dianteira ou mesmo na região da 
articulação temporomandibular (ATM) de ratos. 
 
2.4 - Bibliografia
• HUNSKAAR S, HOLE K. (1987) The formalin test in mice: dissociation between 
inflammatory and non-inflammatory pain. Pain. 30:103-14. [Veja artigo original]
• PARADA CA, TAMBELI CH, CUNHA FQ, FERREIRA SH. The major role of peripheral 
release of histamine and 5-hydroxytryptamine in formalin-induced nociception. 
Neuroscience. 2001;102(4):937-44. [Veja artigo original]
• 2.3) ROVERONI RC, PARADA CA, CECILIA M, VEIGA FA, TAMBELI CH. Development 
of a behavioral model of TMJ pain in rats: the TMJ formalin test. Pain. 2001 
Nov;94(2):185-91. [Veja artigo original]
3. Ensaio da placa quente 
3.1 - Animais
Camundongos ou ratos.
 
3.2 - Tipo de teste
Nocicepção térmica manifesta por reflexo de retirada de pata.
 
3.3 - Detalhamento do teste
A atividade analgésica central pode ser avaliada por meio do teste da placa quente. Neste 
teste, o equipamento, que consiste de uma placa de metal, é aquecido até a temperatura de 
55 (±1) °C. Embora KURAISHI et al (1983) tenha descrito primeiramente o testepara uso 
em camundongos, muitos experimentos são feitos com ratos. Originalmente, camundongos 
suíços de ambos os sexos, com pesos entre 18 e 25g, são colocados sobre a placa aquecida 
e, as respostas ao estímulo térmico (retirada e lambida das patas traseiras ou dianteiras), 
cronometradas. 
 
São feitas duas medidas-controle em intervalos de 30 minutos. Por meio dessas medidas se 
estabelece o tempo de “cut-off”, ou seja, o tempo máximo de permanência do animal sobre a 
placa, calculado como sendo aproximadamente 3 vezes o valor médio da 2ª medida-controle. 
Adotou-se, porém, um cut-off de 25 segundos devido a possíveis lesões que poderiam ser 
causadas na pata do animal pela exposição a tempos superiores. 
 
A primeira leitura-controle tem o objetivo de adaptação dos animais ao ensaio. A segunda 
leitura-controle é utilizada para exclusão do ensaio dos animais que possuem período de 
latência superior a 9,9s, sendo considerada como a resposta-controle do tempo zero. 
 
Os compostos são administrados em seguida à segunda leitura-controle, geralmente, por via 
oral, embora outra via de administração possa ser utilizada. 
 
As medidas do tempo de resposta são registradas em intervalos de 30 minutos após a 
administração durante 2 horas (tempos: 30 min; 60 min; 90 min; 120 min). Os resultados 
são expressos em média ± EPM dos tempos registrados nos lotes de animais. 
 
3.4 - Bibliografia
• KURAISHI; Y. et al. (1983) Separate involvement of the spinal noradrenergic and 
serotonergic systems in morphine analgesia: the differences in mechanical and 
thermal algesic tests. Brain Research, 273: 245-252. [Veja artigo original]
4. Teste de retirada da cauda (Tail Flick test) 
4.1 - Animais
Camundongos ou ratos.
 
4.2 - Tipo de teste
Nocicepção térmica manifesta por reflexo de retirada de cauda.
 
4.3 - Detalhamento do teste
A analgesia promovida pelo sistema nervoso central também pode ser avaliada por meio do 
teste de tail flick, ou retirada de cauda. Este teste pode ser realizado tanto com 
camundongos quanto com ratos. De acordo com KURAISHI et al (1983), camundongos 
suíços de ambos os sexos com pesos entre 18 e 25g, mantidos em jejum por um período de 
8 h, ou ratos pesando entre 100 e 200 g, são colocados no aparelho com a cauda sobre a 
lâmpada (intensidade 9 no aparelho analgesy meter, modelo 7106 da Leticaä) e o tempo que 
os animais levam para retirar a cauda após a aplicação do estímulo térmico é cronometrado. 
 
Da mesma maneira que o teste anterior (hot plate), são feitas duas medidas-controle em 
intervalos de 30 minutos. Por meio dessas medidas se estabelece o tempo de “cut-off” 
(máximo de permanência da cauda sobre a lâmpada), calculado como sendo de 
aproximadamente 3 vezes o valor médio da 2ª medida-controle. Adotou-se, porém, um cut-
off de 15s, devido a lesões causadas na cauda quando exposta a um tempo superior a este. 
 
A primeira leitura-controle tem o objetivo de adaptação dos animais ao ensaio. A segunda 
leitura-controle é utilizada para exclusão do ensaio animais que possuem período de latência 
superior a 7,9s, sendo considerada a resposta-controle do tempo zero. 
 
As drogas a serem testadas são administradas em seguida à segunda leitura-controle, 
geralmente por via oral, podendo, contudo, ser utilizada outra via de administração. 
 
As medidas do tempo de resposta são registradas em intervalos de 30 minutos após a 
administração, durante 2 horas (tempos: 30min; 60min; 90min; 120min). Os resultados são 
expressos em média + EPM dos tempos registrados nos lotes de animais. 
 
4.4 - Bibliografia
• KURAISHI; Y. et al. (1983) Separate involvement of the spinal noradrenergic and 
serotonergic systems in morphine analgesia: the differences in mechanical and 
thermal algesic tests. Brain Research, 273: 245-252. [Veja artigo original]
5. Teste da placa quente modificado
5.1 - Animais
Ratos.
 
5.2 - Tipo de teste
Nocicepção térmica manifesta por reflexo de retirada da pata.
 
5.3 - Detalhamento do teste
Ratos Wistar pesando 120-200g são colocados individualmente no equipamento que consiste 
de uma placa quente com temperatura ajustada em 51ºC. A latência da resposta de retirada 
da pata traseira esquerda é determinada 0, 30, 60, 120, 180, e 240 min após a 
administração do estímulo hiperalgésico, que pode ser feita por diversas vias de 
administração (intraplantar, intratecal, via oral, etc). O tempo máximo permitido para 
permanência dos animais na superfície quente é 20s. Os experimentos devem ser feitos em 
ambiente sem barulho e com ar condicionado (20-22ºC). 
 
A sensibilidade ao calor (hiperalgesia térmica) é definida como o decréscimo no tempo de 
retirada da pata e calculada como a seguir: Δ latência de retirada de pata (s) = (latência de 
retirada de pata esquerda no tempo 0) – (latência de retirada de pata esquerda nos demais 
tempos). 
 
5.4 - Bibliografia
• LAVICH, T.R. et al. (2003) Combined action of vasoactive amines and bradykinin 
mediates allergen-evoked thermal hyperalgesia in rats. Eur J of Pharmacol. 61039, 
1-8; [Veja artigo original]
• LAVICH, T.R. et al. (2005) A novel hot-plate test sensitive to hyperalgesic stimuli and 
non-opioid analgesics. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 38, 445 – 
451. [Veja artigo original]
6. Teste de Randall & Selitto
6.1 - Animais
Ratos.
 
6.2 - Tipo de teste
Hiperalgesia por pressão crescente na pata de ratos.
 
6.3 - Detalhamento do teste
O teste comportamental de Randall & Selitto (1957) é um método para avaliação da 
hipernocicepção bastante utilizado. Para a execução deste teste utiliza-se equipamento 
apropriado denominado analgesímetro (Ugo-Basile, Stoelting, Chicago, IL), que gera 
aumento linear da força (em gramas) sobre a superfície dorsal da pata do animal, até que o 
mesmo produza uma resposta caracterizada pela retirada da pata. O reflexo de retirada da 
pata é considerado representativo do limiar hipernociceptivo, ou seja, a força necessária 
aplicada à pata para que induza uma resposta aversiva a um estímulo nocivo (Limiar 
Nociceptivo de Retirada da Pata - LNRP). A força necessária para que esse animal exiba tal 
resposta é registrada em gramas. O LNRP é avaliado antes e após a administração dos 
estímulos hiperalgésicos ou inflamatórios, que variam de acordo com o experimento. Para 
reduzir o stress, os ratos devem ser habituados ao equipamento 1 dia antes da execução do 
experimentos.
 
6.4 - Bibliografia
• Randall LO, Selitto JJ. A method for measurement of analgesic activity of inflamed 
tissue. Arch Int Pharmacodyn, 1957;111:409-419. [Veja artigo original]
7. Teste de pressão crescente na pata de ratos (von Frey eletrônico) 
7.1 - Animais
Ratos, embora o teste também possa ser realizado em camundongos.
 
7.2 - Tipo de teste
Hiperalgesia por pressão crescente na pata de ratos.
2.5 7.2 - Tipo de teste
Hiperalgesia por pressão crescente na pata de ratos.
O uso de filamentos de von Frey (von Frey, 1896) é um método para avaliar a sensibilidade 
tecidual ao estímulo mecânico bastante utilizado clinicamente. Entretanto, tal método passou 
a ser utilizado também para experimentos laboratoriais, no sentido de avaliar a influência de 
drogas sobre a sensibilidade nociceptiva em animais. Mais ainda, essa técnica foi 
transformada em um método eletrônico usado primeiramente em humanos (JENSEN et al., 
1986) e posteriormente em ratos (MÖLLER et al., 1998). 
2.6
 
2.7 Os experimentos são realizados com um anestesiômetro eletrônico (Modelo 1601C, Life 
Sciences Instruments, Califórnia, EUA), que consiste em um transdutor de pressão conectadoa um contador digital de força expressa em gramas (g). A precisão do aparelho é de 0,1 g. O 
aparelho é calibrado para registrar uma força máxima de 150 g, mantendo a precisão de 0,1 
g até a força de 80 g. O contato do transdutor de pressão à pata dos animais é realizado por 
meio de uma ponteira descartável de polipropileno com 0.5 mm de diâmetro adaptada a este. 
Os animais (ratos ou camundongos) são colocados em caixas de acrílico, cujo assoalho é uma 
rede de malha igual a 5 mm2 constituída de arame não maleável de 1 mm de espessura, 
durante 15 minutos antes do experimento para adaptação ao ambiente. Espelhos são 
posicionados 25 cm abaixo das caixas de experimentação para facilitar a visualização das 
plantas das patas dos animais. O experimentador deve aplicar, por entre as malhas da rede, 
uma pressão linearmente crescente no centro da planta da pata do rato ou camundongo até 
que o animal produza uma resposta caracterizada como sacudida (“flinch”) da pata 
estimulada. Os estímulos são repetidos por até seis vezes, em geral até o animal apresentar 
três medidas similares com uma clara resposta de “flinch” após a retirada da pata. A 
intensidade de hipernocicepção é quantificada como a variação na pressão (D de reação em 
gramas) obtida subtraindo-se a média de três valores expressos em gramas (força) 
observada antes do procedimento experimental (0 hora) da média de três valores em gramas 
(força) após a administração dos estímulos que variam de acordo com o experimento. 
7.4 - Bibliografia
• JENSEN K, ANDERSEN HO, OLESEN J, LINDBLOM U. (1986) Pressure-pain threshold 
in human temporal region. Evaluation of a new pressure algometer. Pain. 25, 313-
323. [Veja artigo original]
• MOLLER KA, JOHANSSON B, BERGE OG. (1998) Assessing mechanical allodynia in 
the rat paw with a new electronic algometer. J Neurosci Methods, 84, 41-47. [Veja 
artigo original]
• VIVANCOS GG, VERRI WA JR, CUNHA TM, SCHIVO IR, PARADA CA, CUNHA FQ, 
FERREIRA SH. An electronic pressure-meter nociception paw test for rats. Braz J Med 
Biol Res. 2004 Mar;37(3):391-9. [Veja artigo original]
• CUNHA TM, VERRI WA JR, VIVANCOS GG, MOREIRA IF, REIS S, PARADA CA, CUNHA 
FQ, FERREIRA SH. An electronic pressure-meter nociception paw test for mice. Braz J 
Med Biol Res. 2004 Mar;37(3):401-7. [Veja artigo original]
8. Teste de pressão constante na pata de ratos
8.1 - Animais
Ratos.
 
8.2 - Tipo de teste
Hiperalgesia por pressão constante na pata de ratos.
8.3 - Detalhamento do teste
Nesta técnica, primeiramente descrita por Randall & Selitto (1957) e modificada por Ferreira 
et al., (1978), o animal é colocado em uma plataforma e mantido em decúbito ventral pela 
mão do experimentador. Qualquer uma das patas traseiras é submetida à pressão constante 
de 20 mmHg aplicada por um pistão de diâmetro aproximado de 2 cm. A pressão é 
interrompida quando o animal exibe reação nociceptiva típica caracterizada por redução dos 
movimentos de fuga, seguida de alterações na freqüência respiratória e fasciculações no 
dorso. A intensidade de hipernocicepção é quantificada pela variação do tempo de reação em 
segundos (D do tempo de reação) obtida subtraindo-se o tempo de reação observado antes 
do procedimento experimental (0 hora) do tempo de reação após a administração de 
substâncias que promovem sensibilização dos nociceptores que variam de acordo com o 
experimento.
 
8.4 Bibliografia
• FERREIRA SH, LORENZETTI BB, CORREA FM. (1978) Central and peripheral antialgesic action of 
aspirin-like drugs. Eur J Pharmacol. 53, 39-48. [Veja artigo original]
• RANDALL LO, SELITTO JJ. A method for measurement of analgesic activity of inflamed tissue. 
Arch Int Pharmacodyn, 1957;111:409-419. [Veja artigo original]
 
9. Hiperalgesia térmica por fonte de luz infravermelha na pata traseira de rato (Teste de 
Hargreaves)
9.1 - Animais
Ratos.
 
9.2 - Tipo de teste
Hiperalgesia térmica por aplicação de luz quente na pata de ratos.
9.3 - Detalhamento do teste
O teste de Hargreaves foi descrito 1988 e consiste no aquecimento, por meio de uma fonte 
radiante de luz infravermelha, da região central da planta da pata traseira de ratos. O 
comportamento nociceptivo é avaliado como a sensibilidade ao calor (hipernocicepção 
térmica), determinada pela latência de retirada da pata do raio de luz. Contudo, o limite 
máximo permitido para exposição da pata ao raio infravermelho é 15 segundos, no sentido de 
evitar danos teciduais. 
 
Os animais são colocados em compartimentos de acrílico individuais posicionados sobre uma superfície de 
vidro especial, que permite a passagem de forma homogênea da luz e do calor. Cinco minutos são 
utilizados para adaptação dos animais ao ambiente. Após esse período, a fonte de luz infravermelho, 
colocada sob cada uma das patas traseiras do animal, é acionada juntamente com um cronômetro 
eletrônico, até que o animal retire a pata e, a fonte de luz e o relógio parem automaticamente. 
 
Duas ou três medidas são realizadas com um intervalo de tempo de 5 a 10 minutos entre as mesmas. As 
medidas de latência de retirada da pata são expressas como avaliações percentuais relativas às patas-
controle (contralaterais) em cada tempo de observação. 
 
9.4 Bibliografia
• HARGREAVES K, DUBNER R, BROWN F, FLORES C, JORIS J. A new and sensitive method for 
measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988 Jan;32(1):77-88. 
FONTE: http://www.dol.inf.br/Html/MetodosExperimentais.html Acesso em 12 de dezembro de 2012