Enzimas em Biotecnologia - Bioprocessos para Produção de Enzimas (Cap. 05)

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BIOPROCESSOS PARA
PRODUÇÃO DE ENZIMAS
Elba P.S.Bon, Nei Pereira Jr.,
Leda Maria Fortes Gottschalk, Paula Sá-Pereira,
José Carlos Roseiro e Maria Antonieta Ferrara
SUMÁRIO
As enzimas industriais são majoritariamente produzidas por microrganismos, embora
alguns biocatalisadores sejamextraídos de tecidos animais e vegetais. Para o desenvolvi-
mento dos processos microbianos de produção de biocatalisadores, diversos aspectos
devem ser otimizados comvistas à obtenção de elevados rendimentos e produtividades:
linhagem produtora, matéria-prima empregada e formulação domeio de cultivo e oti-
mização de parâmetros operacionais. Os processos industriais compreendem um con-
junto de operações que incluem o tratamento damatéria prima, o preparo e esteriliza-
ção demeios de propagação e produção e a fermentação propriamente dita. A esta, se-
guem-se as etapas de separação e concentração de produto, seguidas ou não da sua pu-
rificação. Os processos industriais de produção de enzimas são desenvolvidos, em sua
maior parte, em cultivos submersos aerados, em biorreatores com agitação mecânica,
que permitemmaior controle dos parâmetros operacionais. A batelada alimentada é a
forma mais empregada de condução do bioprocesso. O cultivo no estado sólido é
tambémutilizado, principalmente nos países orientais por apresentar vantagens para a
produçãodealgumasenzimas, especialmente asproduzidaspor fungos filamentosos.
Avanços recentes nas técnicas debiologiamolecular, notadamente a expressãohe-
terólogaemespéciesmicrobianas seguras ede fácil cultivo, têmaumentandoo lequede
enzimas obtidas por processos microbianos, permitindo a obtenção de maiores rendi-
mentos e produtividades. Estas técnicas devemcontinuar a impulsionar a diversificação
e o desenvolvimento da produção de enzimas em escala industrial.
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INTRODUÇÃO
As enzimas estão presentes em todas as células vivas, onde exercema função de catalisa-
dores das reações que compõe as vias catabólicas e anabólicas dometabolismo celular.
Esses biocatalisadores sãomoléculas de proteínas e seu poder catalítico está associado à
conformaçãonativa, que depende de condições específicas de pH, temperatura e força
iônica do meio (ATLAS, 1997; MADIGAN et alii, 2000). Condições ambientais afasta-
das das ótimas podemprovocar a desnaturação da biomolécula, isto é,mudança na sua
estrutura tridimensional nativa, freqüentemente irreversível, acompanhada de perda
de sua atividade catalítica.
Embora alguns biocatalisadores sejamextraídos de tecidos animais (por exemplo,
pancreatina, tripsina, pepsina e renina) e vegetais (por exemplo, papaína, bromelina,
ficina, malte, peroxidase), as enzimas industriais são, na suamaior parte, obtidas a par-
tir de microrganismos (LAMBERT e MEERS, 1983; EUROPEAN COMISSION, 2002;
ANTRANIKIAN, 2005;OLEMPSKA-BEER et alii, 2006; SANT’ANNA JR., 2001). A tabe-
la 5.1 apresenta exemplos de enzimas comerciais microbianas.
Osmicrorganismos são as principais fontes de enzimas industriais e especiais devi-
do àgrande variedadedeatividades catalíticas, à possibilidadedaproduçãodas enzimas
por processos fermentativos emgrande escala coma regularidade necessária e à simpli-
cidadedos requerimentosnutricionais.Muitas enzimas, entretanto, ainda são extraídas
de tecidos vegetais e animais, com sua produção influenciada pela sazonalidade.
Comoas enzimas sãoproteínas, sua estrutura é codificadaporgenes específicos e a
síntese envolve transcrição, tradução e processos pós-traducionais (ATLAS, 1997;
MADIGAN et alii, 2000). Algumas enzimas estão sempre disponíveis e são designadas
constitutivas, enquanto outras, designadas indutivas, são sintetizadas em resposta às
condições ambientais. Com relação a estas últimas, as células possuemmecanismos de
regulação da expressão gênica, que são acionados, dentre outros fatores, por substânci-
as que podem exercer o papel de indutores, ativadores, inibidores ou repressores
(ATLAS, 1997 e MADIGAN et alii, 2000).
A biossíntese da enzima pode ser associada ao crescimento sendo, então, a taxa de
formação de produto proporcional ao aumento da biomassa; ou não associada ao cres-
cimento celular e, nesse caso, a taxade formaçãodeproduto é independenteda taxade
crescimento celular ou varia com a taxa específica de crescimento de forma complexa
(NIELSEN et alii, 2003; SCHMIDELL et alii, 2001).
As enzimas microbianas podem ser intracelulares como a glicose oxidase, peri-
plásmicas como a invertase e a asparaginase de leveduras ou extracelulares, como as
proteases e as carboidrolases. As enzimas microbianas excretadas são normalmente
mais estáveis e produzidas emmaiores quantidades. Estes biocatalisadores têm a fun-
ção principal de degradarmacromoléculas presentes nomeio ambiente, como a celu-
lose, o amido, a lignina e proteínas, para absorção dee seus componentes comonutri-
entes.
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO96
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Tabela 5.1 Exemplos de enzimas comerciais obtidas a partir de microrganismos
Enzima Microrganismos produtores
aminopeptidase Aspergillus niger, A. oryzae, Lactococcus lactis, Rhizopus oryzae
Alfa-amilase Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, B.
licheniformis
Catalase Aspergillus niger, Micrococcus luteus
Celulase Aspergillus niger, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, Humicola
isolens, Streptomyces lividans, Trichoderma reesei. T. viride,
Dextranase Chaetomium erraticum, Penicilium lilacinum
Alfa-galactosidase Aspergillus niger,
Beta-glucanase Aspergillus niger, A. aculeatus, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis,
Humicola isolens Talaromyces emersonii
Fitase Aspergillus niger
Glucoamilase Aspergillus niger, Rhizopus delemar, R. niveus, R. oryzae
Glicose isomerase Streptomyces murinus, S. olivochromogenes,
Hemicelulase Aspergillus niger, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis
Inulase Aspergillus niger
Invertase Saccharomyces cerevisiae
Lactase Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis,
Lípase Aspergillus niger, Penicilium camembertii, Candida lipolytica, C.
rugosa, P. roqueforti, Rhizopus oryzae
Pectinase Aspergillus aculeatus, A. niger, A. pulverulentuns, Penicilium
funiculosum
Protease Bacillus halodurans, Aspergillus melleus, A. niger, A. oryzae, B. subtilis,
B. licheniformis, Penicilium citrinum, Rhizopus niveus, S. fradiae
Pululanase Bacillus acidopullulyticus, B. circulans
Xilanase Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Humicola insolens, Penicilium
funiculosum, Trichoderma reesei
Fonte: European Comission, 2002.
Embora a maioria das enzimas industriais seja exocelular e produzida por fungos e
bactérias, a tecnologia do DNA recombinante vem sendo crescentemente utilizada para a
produção de biocatalisadores. No atual estágio de conhecimentos, é teoricamente possível
expressarqualquerenzimade interesse, codificadaporgenesdeorigemanimal, vegetal ou
de microrganismos, em microrganismos hospedeiros bem adaptados à fermentação em
larga escala. É de especial importância a expressão heteróloga nas bactérias Escherichia
coli,Bacillus subtilis eB. licheniformis, nas leveduras Saccharomyces cerevisiae,Pichia pas-
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toris eHansenula polymorpha (estas duas últimasmetilotróficas) e nos fungosAspergillus
niger e Aspergillus oryzae (CEREGHINO e CREGG, 2000; GELLISSEN, 2000; ADRIO e
DEMAIN, 2003;OLEMPSKA-BEER et alii, 2006). Exemplos de enzimas comerciais produ-
zidas por microrganismos recombinantes são apresentados na tabela 5.2.
Tabela 5.2 Exemplos de enzimas comerciais produzidas por microrganismos recombinantes.
Enzima Organismo doador do gene Microrganismo hospedeiro
aminopeptidase Aspergillus sp. Trichoderma reesei
Alfa-amilase Thermoactinomyces sp. Bacillus amyloliquefaciens,
B. subtilis
Arabinofuranosidase Aspergillus sp. Aspergillus niger
Catalase Aspergillus sp. Aspergillusniger
Celulase Myceliopthora sp. Aspergillus oryzae
Quimosina Estômago de bezerro Escherichia coli
Ciclodextrina gluconotransferase Thermoanaerobacter sp. Bacillus licheniformis
Alfa-galactosidase Guar (planta indiana) Saccharomyces cerevisiae
Beta-glucanase Trichoderma sp. Trichoderma reesei
Fitase Peniophora sp. Aspergillus niger
Glucoamilase Dado não disponível Pichia pastoris
Glicose isomerase Actinoplanes sp. Streptomyces lividans
Lacase Myceliopthora sp. Aspergillus oryzae
Lactase Kluyveromyces sp. Kluyveromyces lactis
Lípase Rhizomucor sp. Aspergillus oryzae
Pectina liase Bacillus sp. Bacillus licheniformis
Penicilina amidase Alcaligenes sp. Alcaligenes faecalis
Protease Rhizomucor sp. Aspergillus oryzae
Pululanase Bacillus sp. Bacillus subtilis
Xilanase Bacillus sp. Bacillus subtilis
Fonte: European Comission, 2002.
Abrindo ainda mais o leque de possibilidades do uso industrial de enzimas, exis-
temos biocatalisadores produzidos pormicrorganismos extremófilos e, particularmen-
te, por aqueles do domínio Archea. Estes microorganismos vivem em ambientes hoje
considerados exóticos, mas que eram comuns na terra primitiva, tais como temperatu-
ras elevadas, em alguns casos superiores a 100�C, alta salinidade, valores de pH inferio-
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res a 2,0 ou superiores a 10,0 e estresse nutricional. Apesar dos extremófilos serem co-
nhecidos hámais de 40 anos, só recentemente foi intensificada a busca por novas espé-
cies. O interesse biotecnológico corrente em enzimas destes microrganismos émotiva-
do por sua estabilidade em condições normalmente desnaturantes para enzimasmeso-
fílicas. As extremozimas, além da sua termoestablidade, são mais estáveis ao pH, con-
centração de sais, pressão, solventes orgânicos emetais pesados, do que as enzimasme-
sofílicas, e sua atividade pode aumentar na presença de alguns detergentes. Seu uso po-
deria, em princípio, eliminar a necessidade da adição de reagentes estabilizadores de
enzimas, reduzindo os custos de processos enzimáticos.
Atenção particular vem sendodada às extremozimas demicrorganismos extremó-
filos e hipertermófilos. Umgrande número de extremozimas de arquéas hipertermofí-
licas, intracelulares ou extracelulares, tem sido investigado edados referentes à suapro-
dução,purificação, caracterizaçãoestrutural e funcional estãodisponíveisna literatura.
As extremozimas podem também formar a base de processos inteiramente novos.
Oexemplomaismarcante é aTaqpolimerase, deThermusaquaticus, queéempregada
amplamente nos procedimentos de PCR (polymerase chain reaction). Esta técnica, in-
ventada emmeados dadécadade 80porKaryMullis daCetusCorporation, é atualmen-
te a base para análises forenses, como, por exemplo, omapeamento deDNA (DNA-fin-
gerprinting) para exames de paternidade e procedimentos de criminalística. A técnica
PCR, também usada em diversas áreas de pesquisas e em diagnósticos médicos (por
exemplo, na detecção de infecção por HIV), aumentou a sensibilidade das técnicas de
procura de várias doenças genéticas, incluindo algumas formas de câncer.
Na PCR, uma enzima conhecida comoDNApolimerase, copia repetidas vezes a fita
de DNA, produzindo grande quantidade de material genético. Este processo requer o
aquecimento e resfriamento damistura de reação em repetidos ciclos. Na época emque
Mullis inventou a técnica, a polimerase utilizada era originária de microrganismos que
não eram termófilos e, assim, a atividade cessava na etapa de incubação a quente do pro-
cedimento e era necessária a reposiçãomanual da enzima a cada ciclo. Para solucionar o
problema, no final da década de 80, os pesquisadores isolaram a DNA polimerase de
Thermus aquaticus (Taq polimerase), que émuito tolerante ao calor, o que levou ao de-
senvolvimento de uma tecnologia de PCR totalmente automatizada. Esta bactéria termo-
fílica foi isolada, em1965, deumapiscinadeágua ferventedoParqueNacional Yellowsto-
ne, nos Estados Unidos da América. Para sobreviver, T. aquaticus sintetiza enzimas que
atuamemtemperaturas elevadas, dentreasquaisumaDNApolimerase, queauxilia abac-
téria aproduziro seupróprioDNA.ApolimerasedeT. aquaticus é ativa emtemperaturas
superiores a 95°C. Outras aplicações de PCR envolvem tanto exames de paternidade e
análises emcriminalística.Mais recentemente, alguns usuários de PCRpassarama substi-
tuir a Taq polimerase pela Pfu polimerase, isolada da Archaea hipertermofílica Pyrococ-
cus furiosus, que tematividadeótima em100�C.Opotencial industrial das extremozimas
émuito grande e, por esta razão, onúmerode extremozimas isoladas, clonadas e caracte-
rizadas vem aumentando rapidamente (ANDRADE et alii, 1999; ANTRANIKIAN et alii,
2005; ATLAS, 1997; EUROPEANCOMISSION, 2002; JORGENSEN, 1997;MADIGAN et
alii, 2000; MORACCI, 1995; NUNES, 1995; STETTER, 1999; WOESE et alii, 1990).
Apesar das diferenças existentes entre as diversas classes de microrganismos pro-
dutores de enzimas, principalmente entre os procariotas e eucariotas, e também entre
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as enzimas com relação a massa molecular, propriedades físico-químicas e grau de gli-
cosilação, os mecanismos básicos da biossíntese enzimática são similares o suficiente
para permitir um tratamento genérico do processo microbiano da sua produção.
MICRORGANISMOS PRODUTORES: CARACTERÍSTICAS E
NUTRIÇÃO
Aprimeira etapadaproduçãomicrobianadeumaenzimade interesse consiste na iden-
tificaçãoeaquisiçãodomicrorganismoprodutor, quepode seruma linhagemselvagem
oumodificada por genética clássica ou por técnicas de biologiamolecular. A linhagem
de interesse pode ser adquirida de coleções de cultura científicas ou de serviço ou sele-
cionada a partir de amostras de solo, água, ar, tecidos vegetais como caules ou frutas em
decomposição, fezes de animais e vísceras de insetos como os cupins e outras fontes.
Idealmente, omicrorganismoa serutilizadoemumprocessodeproduçãodeenzi-
ma deve ter as seguintes características:
� Ser seguro sob o ponto de vista biológico (status GRAS – generally recognized as
safe).
� Apresentar elevada capacidade de síntese e excreção da enzima.
� Suportar condições ambientais adversas, relacionadas comapressão osmótica, a
temperatura e a força iônica do meio.
� Ser tolerante à presença de substâncias tóxicas, que podem ser geradas no pro-
cesso de tratamento da matéria-prima ou pelo próprio metabolismo celular.
O melhoramento de linhagens produtoras, para atender total ou parcialmente os
critérios acima, temsido fundamental para aproduçãodeenzimas em larga escala.Amu-
tagênese clássica era tradicionalmente empregada comeste objetivo.Ouso recentemen-
te da tecnologia do DNA recombinante permite o aumento substancial do rendimento
emenzimaatravésdautilizaçãodepromotoreseficientes eda introduçãodemúltiplas có-
pias do gene que codifica para a enzima de interesse (PENG et alii, 2005; EUROPEAN
COMISSION, 2002; ADRIO e DEMAIN, 2003; OLEMPSKA-BEER et alii, 2006).
A manutenção e a preservação de microrganismos são etapas de extrema impor-
tância para assegurar a sua viabilidade eprevenirmudanças genéticas que levemà redu-
ção ou perda de propriedades fenotípicas. Técnicas de manutenção e conservação de
microrganismos estão amplamente descritas na literatura e incluem repicagens perió-
dicas, conservação emparafinaouemglicerol, liofilização e crioconservação (DEMAIN
e SOLOMON, 1986).
O crescimento domicrorganismo em biorreatores para a produção da enzima de
interesse está diretamente relacionado à disponibilidade das substâncias necessárias a
suas necessidades nutricionais. Água, fontes de carbono e energia, nitrogênio e oxigê-
nio são algumas das necessidades comuns a todos os microrganismos. Os microrganis-
mos necessitam ainda de elementos minerais tais como fósforo, enxofre, potássio, cál-
cio, magnésio, sódio, ferro e, emalguns casos, cloro. Requerem também os chamados
elementos traços, que desempenham importante papel como constituintes de enzimas
e coenzimas. Estes últimos incluem manganês, cobre, zinco, molibdênio, cromo, ní-
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO100
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quel, cobalto e boro e são, em geral, necessários em pequenas quantidades
(JENNINGS, 1988).
Opotencial parametabolizar fontesde carbono varia entreosmicrorganismos.De
uma forma geral, os compostos orgânicos da natureza, incluindo desde os chamados
compostos C1 (CO, CO2, formaldeído, metanol, metilamina), até as macromoléculas
complexas (amido, proteínas, lipídios, celulose, hemicelulose, lignina, ácidos nucléi-
cos), podem ser utilizados como fonte de carbono e/ou energia, desde que os micror-
ganismos possuam os sistemas enzimáticos extra- e intracelulares e de transporte ade-
quados. As macromoléculas são inicialmente convertidas extracelularmente a subuni-
dadesmenores por enzimas hidrolíticas, sendo, então, transportadas para o interior da
célula e metabolizadas em vias catabólicas e/ou anabólicas. Os carboidratos são a prin-
cipal fonte de carbono e de energia, sendo a glicose a fonte de carbono universal
(KRÄMEReSPRENGER, 1993;MADIGANet alii, 2000;ATLAS, 1997;CORTE-REALet
alii, 2003).
Osmicrorganismos apresentamgrandediversidadena assimilaçãode fontes deni-
trogênio: os autotróficos são capazes de utilizar nitrato, amônio e, em alguns casos, ni-
trogênio gasoso comoúnica fonte de nitrogênio.Outros, entretanto, necessitamdo su-
primento deste elemento sob a forma de compostos orgânicos, como aminoácidos ou
uréia (MADIGAN et alii, 2000).
Muitosmicrorganismos são incapazesde sintetizar certos aminoácidos, purinas, piri-
midinas ou vitaminas que, sendo constituintes obrigatórios de proteínas estruturais ou
funcionais, ácidos nucléicos ou coenzimas, devem ser adicionados ao meio de cultura
sempre que necessário. Estas substâncias são denominadas fatores de crescimento
(MADIGAN et alii, 2000). Ressalta-se quemicrorganismos recombinantes podem reque-
rer a complementação do meio de cultura com fatores de crescimento como resultado
dos procedimentos deBiologiaMolecular, quemuitas vezes utilizammarcadores nutrici-
onaisparaa seleçãodos transformantes (GLAZEReNIKAIDO,1995;WALKER,1998).
Ooxigênio faz parte da composiçãodamaioria dasmoléculas que constituemaes-
trutura celular e das que integram ometabolismo. Assim sendo o seu suprimento sob a
forma gazosa e/ou ligado molecularmente é essencial para a manutenção do metabo-
lismo da maior parte dos microrganismos aeróbios ou anaeróbios.
MEIOS DE CULTURA PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS
Ascaracterísticas físico-químicasdomeiodecultivo sãode fundamental importância,não
apenas para o crescimento celular como também para o rendimento em produto. Isto
ocorre porque as células são capazes de responder aos estímulos químicos e físicos do
meioexternoatravésdemecanismosbioquímicosque regulamaexpressãogênicaea fisi-
ologiadomicroorganismoe,porextensão, seudesempenhona formaçãodoprodutode-
sejado. Conforme já mencionado, esses mecanismos são acionados, dentre outros fato-
res, por indutores, ativadores, inibidores e repressores (ATLAS, 1997; MADIGAN et alii,
2000).
A regulação por glicose da produção de enzimas extracelulares tem sidomuito es-
tudada e é bem conhecido o efeito repressor deste açúcar na produção de varias enzi-
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mas, como celulases, amilases (LAMBERT e MEERS, 1983) e invertase (DYNESEN et
alii, 1999; GEORIS et alii, 1999). Recentemente, a regulação por nitrogênio passou a
despertar interesse devido ao efeito negativo do sulfato de amônio na produção de al-
gumas enzimas como ligninases, peroxidases eparticularmente glicoamilaseproduzida
por Aspergillus awamori (BON, 1993).
A regulação por nitrogênio de enzimas intracelulares de levedura tem sido extensi-
vamente estudada (MAGASANIK e KAISER, 2002) assim como a interrelação entre as
vias de sinalização da regulação da expressão gênica via o circuito do carbono e do nitro-
gênio (BERTRAM, 2002;COOPER, 2002). Adicionalmente, a partir dos estudos da regu-
laçãopornitrogêniodaenzimaasparaginase II, localizadanoespaçoperiplásmicodeSac-
charomyces cerevisie, e cuja atividade aumenta durante a estarvação por nitrogênio
(DUNLOP e ROON, 1975), aprofundaram-se os estudos sobre sua regulacão por nitro-
gênio e tambémada enzima invertase, igualmente localizada no periplasma da célula da
levedura (BOM,1997;OLIVEIRA, 2003;OLIVEIRA, 2005).Estes trabalhos identificaram
padrões comuns da regulação por nitrogênio das enzimas intracelulares e periplásmicas
de leveduras, indicandoa importânciadesta regulaçãonaexpressãodosgenesquecodifi-
campara enzimas industriais de interesse e por extenção no rendimento do processo de
produção. Assim sendo, identificada a regulação por nitrogênio, deve ser evitado, na for-
mulação domeio de cultivo, o uso de fontes de nitrogênio repressoras, como amônio, e
favorecido o uso de fontes não repressoras, como uréia ou prolina.
Processos microbianos industriais podem utilizar meios de composição quimica-
mente definida oumeios complexos.Noprimeiro caso, os componentes domeio são, na
medidadopossível, qualitativa e quantitativamente conhecidos. Essesmeios apresentam,
emgeral, elevadocustoe sãoempregadosprincipalmenteparaaproduçãodeenzimas te-
rapêuticas. Os meios de composição complexa, utilizados namaioria dos processos, em-
pregam matérias-primas industriais, provenientes principalmente do setor agrícola,
comoporexemplo,melaço, açúcarnão refinado, licor sulfítico, sucosde fruta emateriais
amiláceos (milho, arroz, batata, trigo, etc.) (EUROPEANCOMISSION,2002;KRISHNA,
2005; SPENCER-MARTINS e SÁ-NOGUEIRA, 2003).
A matéria-prima é um dos componentes mais relevantes nos custos de produção,
podendo representar, em alguns casos, até 75% do custo total, sendo esta uma das ra-
zões para o crescente interesse no aproveitamento de resíduos lignocelulósicos agroin-
dustriais e florestais como matérias-primas para processos microbianos industriais.
Estes resíduos, dentre os quais destacam-se bagaçode cana-de-açúcar, sabugodemilho,
palha de arroz e farelo de trigo, são de grande interesse por não possuírem custos de
produção diretos. O uso em bioprocessos representa, assim, uma forma de se agregar
valor a resíduos abundantes, dando soluçãopara seu acúmulo, que representa umsério
problema ambiental.
Viabilidade técnica, balanços energéticos e economicidade sãoaspectos relevantes
que devem ser considerados na escolha damatéria-prima. Em geral, esta deve apresen-
tar as seguintes características:
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO102
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� Ter composição adequadapara o crescimento domicrorganismoe formaçãodo
produto de interesse.
� Ter baixo custo de obtenção, beneficiamento, transporte e estocagem.
� Ter elevada disponibilidade e facilidade de padronização dos componentes.
�Não contribuir para dificultar os processos de separação do produto.
O perfil das matérias-primas tradicionalmente utilizadas nos processos microbia-
nos convencionais não sofreu significativasmodificaçõesnosúltimos cinqüenta anos.O
uso da tecnologia do DNA recombinante, entretanto, vem gradativamente aumentan-
do a importância de fontes de carbono pouco utilizadas anteriormente. Como exem-
plo, a crescente utilizaçãodas levedurasmetilotróficasPichia pastoris eHansenula poly-
morpha,para aproduçãode enzimas recombinantes preconiza o seu crescimento inici-
al em fontes de carbono menos repressoras como o glicerol e a indução do gene de
interesse com metanol (CEREGHINO e CREGG, 2000; GELISSEN, 2000).
As principais fontes de carbono e energia para os processos microbianos são os
açúcares, como glicose e sacarose. Outras importantes fontes são as matérias-primas
amiláceas e lignocelulósicas.
Os substratos na formapoliméricapodemexigir hidrólise prévia, química ou enzi-
mática, seoagentemicrobianonão for capazde sintetizar enzimas extracelularesneces-
sárias para a sua degradação. No caso de fermentações no estado sólido, pode-se pres-
cindir de pré-tratamentos, intensivos em energia e, conseqüentemente, onerosos, já
que muitos microrganismos têm a habilidade de atacar o complexo contendo os
polissacarídeos e outras macromoléculas.
A escolha da fonte de carbono é muito importante pois a síntese de diversas enzi-
mas está sujeita à repressão catabólica. A glicose, por exemplo, apesar de ser, em geral,
excelente fonte para crescimento celular, tem sido reportada, conforme já menciona-
do, como repressora para a produção de diversas enzimas, comoá-amilase, celulase e
invertase. Para manter baixa a concentração de carboidrato durante o processo fer-
mentativo, este pode ser adicionado gradativamente durante o processo fermentativo
(batelada alimentada) ou ainda podem ser utilizadas fontes de assimilação lenta, como
amido ou lactose. Para a obtenção de rendimentos elevados de alguns biocatalisadores,
como lactase e pectinase, a presença do substrato é requerida para indução da síntese
da enzima (MADIGAN et alii, 2000).
Entre as fontes de nitrogênio inorgânicas, o sulfato de amônio é o salmais utilizado
devido ao seu baixo custo, mas pode-se também empregar o nitrato de sódio. Adicional-
mente, existe uma grande disponibilidade de fontes de nitrogênio orgânico de grande
aplicação emprocessosmicrobianos industriais, como a uréia. As principais fontes de ni-
trogênio complexas empregadas são: extrato de levedura, rico em vitaminas do comple-
xo B e aminoácidos; licor damaceração domilho, subproduto da industrialização domi-
lho, fonte bem balanceada em carbono, nitrogênio, enxofre e sais minerais, contendo
ainda vitaminas, como riboflavina, niacina, ácido pantotênico, biotina e piridoxina; fari-
nha de soja, resíduo da indústria de produção de óleo de soja, rico emnitrogênio, o qual
CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 103
1ª prova
é, entretanto,mais complexo edemais difícil assimilaçãodoqueonitrogênio do licor da
maceração do milho (EUROPEAN COMISSION, 2002; SANT’ANNA JR., 2001).
Damesma formaque as fontes de carbono, as fontes denitrogêniodevemser esco-
lhida com bastante critério. Conforme mencionado anteriormente, fontes de nitrogê-
nio chamadas de preferenciais, ricas ou de fácil metabolismo, como o íon amônio, a
glutamina, a asparagina e amistura de aminoácidos e peptídeos presentes napeptona e
em outros concentrados protéicos comerciais, são repressoras da produção de diversas
enzimas. Ao contrário, prolina e uréia, ornitina e alantoina, entre outros, chamadas de
fontes não preferenciais, pobres ou de difícil metabolismo, são fontes de nitrogênio
não repressoras e, portanto, o seu uso favorece, em geral, a produção de enzimas
(ADRIO,2003;WALKER,1998;MAGASANIKeKAISER, 2002;BONeWEBB,1993).
A otimização da composição domeio de cultura para obtenção domáximo rendi-
mento em produto não é uma tarefa fácil. Abordagens empíricas têm sido tradicional-
mente adotadas, nas quais os efeitos de cada componente domeio sobre o rendimento
em biomassa e produto são investigados em frascos agitados. As fontes de carbono são
examinadas e, posteriormente, as fontes de nitrogênio, até que todas as combinações
dos componentes domeio tenham sido examinadas, determinando-se assim omeio de
composição otimizada. Ressalte-se que este procedimento envolve um grande número
de experiências e demanda bastante tempo, sendo os constituintes investigados
individualmente e, via de regra, ignorados os efeitos interativos entre os mesmos.
Métodos estatísticos, que permitem otimizar as concentrações dos componentes
fundamentais do meio, podem ser utilizados para aumentar a eficiência desta etapa.
Após seleçãodosprincipais componentesdomeioqueafetamorendimentoemprodu-
to e produtividade, eles são combinados em altas e baixas concentrações (ausente, se
não essencial para o crescimento), de acordo com umametodologia estatística (plane-
jamento fatorial), que permite o planejamento de 2nexperimentos, onde ‘n’ é o núme-
rode variáveis envolvidas.Desta forma, o efeitodeumcomponente individualno rendi-
mento emproduto pode ser determinado comumnúmero relativamente pequeno de
experimentos, mesmo que os demais componentes variem (DEMAIN e SOLOMON,
1986; RODRIGUES e IEME, 2005).
O valordopHdomeiode cultura éparâmetrode fundamental importância e tam-
bémdeve ser otimizado, de forma a proporcionar umbomcrescimento celular e eleva-
dos rendimentos em produto, devendo-se levar em conta, logicamente, a preservação
da atividade biológica da enzima. Se a produção da enzima de interesse não for associa-
da ao crescimento celular, o valor do pH ótimo da etapa de crescimento pode ser dife-
rente daquele da etapa de produção do biocatalisador. Este é o caso da produção de di-
versas enzimas heterólogas pela levedurametilotróficaPichia pastoris, comopor exem-
plo, a enzima asparaginase (FERRARA et alii, 2006).
PROCESSOS MICROBIANOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS
Oprocessomicrobiano de produção de enzimas, quer nativas ou recombinantes, com-
preendeumconjunto de operações que incluemo tratamento damatéria prima, o pre-
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO104
1ª prova
parodemeiosdepropagaçãoeprodução, a esterilizaçãoea transformaçãodo substrato
em produto por via bioquímica, seguida de processos de separação e purificação do
produto. Um esquema simplificado é apresentado na figura 5.1.
CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 105
1ª prova
Figura 5.1 Esquema simplificado de um processo microbiano de produção de enzima.
TRATAMENTO DA
MATÉRIA PRIMA
PREPARO DO
MEIO
EFLUENTE /
RESÍDUO
TRATAMENTO /
APROVEITAMENTO
ESTERILIZAÇÃO
BIORREATOR DE
PROPAGAÇÃO
BIORREATOR
DE PRODUÇÃO
INOCULAÇÃO
BANCO DE
CÉLULAS
FILTRAÇÃO
DO AR
AERAÇÃO
SEPARAÇÃO
DE CÉLULAS
BIOMASSA
MEIO ISENTO
DE CÉLULAS
ROMPIMENTO
CELULAR
PURIFICAÇÃO DA
BIOMOLÉCULA
INTRACELULAR
PURIFICAÇÃO DA
BIOMOLÉCULA
EXTRACELULAR
BIOMOLÉCULA
COM ALTO GRAU
DE PUREZA
BIOMOLÉCULA
COM ALTO GRAU
DE PUREZA
EFLUENTE /
RESÍDUO
TRATAMENTO / APROVEITAMENTO
Esterilização
Amaior parte dos processos de produçãode enzimas ocorre comculturas puras. Assim,
para prevenir contaminações, o bioprocesso é conduzido sob condições assépticas. Os
substratos sólidos são mantidos em câmaras a temperatura elevada por períodos de
tempo apropriados, enquanto que os meios líquidos são esterilizados no próprio bior-
reator ou em vasos separados.
Aesterilizaçãocomvapor saturado sobpressãoéamaisusualparameiosdeculturae
equipamentos, e pode ser realizada em conjunto ou separadamente e, ainda, em batela-
daoude formacontínua (BAILEYeOLLIS, 1986;RAJUeCOONEY, 1993; SCHMIDELL
et alii, 2001).
Na prática industrial, é comum a esterilização de meios de cultura de forma des-
contínua em conjunto com o biorreator, fazendo-se passar vapor saturado sob pressão
através de serpentinas ou camisas (aquecimento indireto), ou introduzindo-se o vapor
saturadopelodifusordo vaso, sob agitaçãomínima(aquecimentodireto).Nesteúltimo
caso, deve-se levar emconsideração a diluição domeio de cultura causada pela conden-
sação do vapor ao entrar em contato com a superfíciemais fria domeio. A temperatura
usual de esterilização é de 121�C.
Na esterilização descontínua, o tempo total de esterilização é relativamente gran-
de, podendodarorigemàdecomposiçãodenutrientes termo-sensíveis, comoas vitami-
nas, ou provocar reações indesejáveis entre os constituintes do meio, como por exem-
plo, reações entre aminoácidos e açúcares (reação deMaillard). Estamodalidade de es-
terilização vem sendo substituída, sempre que possível, pela esterilização contínua, na
qual a integridade dos constituintes do meio é conservada mais eficazmente, jáque o
aquecimento e o arrefecimento são praticamente instantâneos.
Emprocessos aeróbicos, o ar deve ser esterilizado antes de ser fornecido à cultura.
Esta esterilização normalmente é efetuada por filtração com lã de vidro, material sinte-
rizadooumembranas apropriadas (SANT’ANNAJR., 2001;EUROPEANCOMISSION,
2002; RAJU e COONEY, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001).
Fermentação
Os processos microbianos de produção de enzimas ocorrem basicamente em cultivos
submersos e cultivos no estado sólido, sendo os primeiros os mais utilizados industrial-
mente.
Cultivo submerso
Os processos submersos são aqueles em que a célula produtora se desenvolve no seio do
meiodecultivo, sobagitação.Nocasode fermentações aeróbicas, ooxigênionecessário à
populaçãoemdesenvolvimentoé supridoporborbulhamentodearno líquidoatravésde
umcompressor. As fermentações são conduzidas embiorreatores aerados e agitadosme-
canicamente (figura 5.2), em geral com volumes entre 20 e 200m3, podendo chegar a 1
000m3.Osparâmetros operacionais, tais comopH, temperatura, consumodeoxigênio e
formação de dióxido de carbono, são medidos e rigidamente controlados (MCNEIL e
HARVEY, 1990; LAMBERT e MEERS, 1983; EUROPEAN COMISSION, 2002).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO106
1ª prova
Os processos submersos oferecem uma série de vantagens, tais como:
� Facilidade de controle de variáveis físico-químicas do processo.
�Maior eficiência de absorção de nutrientes e excreção demetabólitos pela célu-
la, levando a menores tempos de processo e conseqüentemente, a ganhos em
produtividade.
Dentre as desvantagens podem ser citados:
� Elevados custos com aeração e agitação, especialmente quando do uso demeios
reacionais com alta viscosidade e reologia complexa.
� Formação de espuma.
Os bioprocessos submersos podem ser operado de três modos: batelada simples,
batelada alimentada ou contínuo. A batelada simples, na qual uma suspensão celular é
adicionada ao meio de cultivo e o processo é transcorrido sem adição ou retirada de
meio reacional, já foi a formamais utilizada de produção de enzimasmicrobianas, sen-
do, hoje em dia, pouco empregada. Caracteriza-se por alterações nas condições ambi-
entais a dutante todo o processo: as concentrações de nutrientes diminuem e de célu-
las, produtos e subprodutos aumentam(BAILEY eOLLIS, 1986;NIELSEN et alii, 2003;
NIELSENeVILLADSEN, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001).Oprincipal problemadesta
forma de operar processos microbianos é decorrente de fenômenos de inibição pelo
substrato, produto ou outros metabólitos.
CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 107
1ª prova
Figura 5.2 Biorreator agitado mecanicamente.
Para contornar os problemas de inibição/repressão, outras formas de condução
podem ser utilizadas, como a batelada alimentada e suas variantes, que permitem ama-
nutençãoda concentraçãodessas substâncias emníveis subinibitórios/sub-repressores,
com implicações diretas no desempenho da célula (NIELSEN e VILLADSEN, 1993;
SCHMIDELL et alii, 2001).
Abatelada alimentada édefinida comoummododeoperação emqueumoumais
nutrientes necessários ao crescimento celular e/ou formação de produto são adiciona-
dos ao biorreator de forma intermitente ou continua, semque ocorra retirada demate-
rial durante a operação.
A flexibilidadedeoperaçãooferecidapor esta formade fermentaçãoé adequada a
processos microbianos em que o crescimento celular e/ou formação de produtos são
significativamente sensíveis à concentraçãodo substrato limitante.Éadequadaàprodu-
çãode várias enzimas extracelulares, uma vezque a formaçãodestas biomoléculas ému-
itas vezes sujeita à repressãopelo substrato.Emboraa cultura embatelada simples tenha
sido inicialmente utilizada em muitos bioprocessos, a prática industrial mostra que o
cultivo em batelada alimentada tem efeito favorável no acúmulo demuitas enzimas ex-
tracelulares, sendo este processo hoje emdiamuito utilizado na indústria de produção
deenzimas tais comoamilases, celulases eproteases (EUROPEANCOMISSION,2002).
Este modo de condução do bioprocesso tem sido também empregado com suces-
so para a produção de enzimas heterólogas pela levedurametilotrófica Pichia pastoris.
Neste caso, preconiza-se um cultivo multiestágio que permite atingir elevadas densida-
des celulares (daordemde100g l-1 empeso seco), noqual, inicialmente, a célula cresce
em glicerol em batelada alimentada e, em seguida, a expressão da enzima é induzida
através do cultivo em metanol, também em batelada alimentada (GELISSEN 2000;
CEREGHINO e CREGG, 2000; FERRARA et alii, 2006).
Apesar dos processos em batelada simples ou batelada alimentada serem emprega-
dos commais freqüência, a cultura contínua, naqual a alimentaçãodenutrientes e a reti-
radadeprodutos é efetuada continuamentedurante oprocesso fermentativo (NIELSEN
e VILLADSEN, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001), é empregada em algumas situações,
como para a produção de glicose isomerase por Bacillus coagulans (LAMBERT e
MEERS, 1986).
Aprincipal vantagemda cultura contínua está ligada àpossibilidadede se operar o
sistema por extensos períodos de tempo, resultando em aumento de produtividade.
Adicionalmente, o agente biológico converte substrato em condições estacionárias,
quepodemserdeterminadas previamenteparao seumelhordesempenho.Outras van-
tagens da condução contínua podem ser apontadas (BRITO, 2000): inexistência de
tempos improdutivos, levando o fermentador a permanecermuitomais tempo em ser-
viço; as operaçõesqueantecedeme sucedemoprocessopodemser realizadas continua-
mente; possibilidade de instrumentação e controle automático, reduzindo os gastos
commão-de-obra; e maior uniformidade do produto, tendo em vista que as condições
ambientais sãomantidas constantes.Os principais problemas dessa formade condução
sãoabaixa concentraçãodaenzimaemcomparaçãoàbatelada alimentadaeoalto risco
de contaminação e de degeneração da linhagem microbiana (EUROPEAN
COMISSION, 2002).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO108
1ª prova
Cultivo no estado sólido
Não obstante a fermentação submersa ter sido durante muito tempo, e ser até hoje, a
tecnologiamais empregadapara aproduçãodeenzimas, existe grande interesse emuti-
lizar a fermentação no estado sólido com esta finalidade.
A fermentaçãonoestado sólidoédefinida comoumprocesso emqueocrescimen-
to microbiano e a formação de produto ocorrem na superfície de substratos sólidos na
ausência de água livre. É distinta da fermentação submersa, em que, via de regra, os
substratos e outros nutrientes encontram-se na forma solúvel.Os substratos tradicional-
menteutilizados sãoprodutos agrícolas, comoarroz, trigo, painço, cevada,milhoe soja,
alémde substratos não convencionais, comoos resíduos agroindustriais e florestais. Em
linhas gerais, a operação da fermentação no estado sólido pode ser realizada sem agita-
ção mecânica, com agitação ocasional ou contínua, ou em colunas recheadas com cir-
culação de líquido (MITCHELL et alii, 2000; PANDEY et alii, 2000; PANDEY et alii,
2001; KRISHNA, 2005; COUTO e SANROMÁN, 2006).
A fermentação no estado sólido apresenta as seguintes vantagens:
� Simplicidade dos meios de cultivo (o substrato sólido pode requerer somente
adição de água, embora outros nutrientes possam ser adicionados).
� Ausência de requerimentos de máquinas e equipamentos sofisticados.
� Possibilidade de uso de biorreatores com dimensões menores pelo fato do subs-
trato estar concentrado.
� Reduzido consumo de energia.
� Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminação.
� Condições de crescimento do microrganismo semelhantes às encontradas em
seu ambiente natural.
�Maiores concentrações de enzima em relação às fermentações submersas.
� Estabilidade da enzima excretada e baixo nível de repressão catabólica.
� Ausência de formação de espuma.
� Possibilidade de extração imediata do produto através da adição direta de sol-ventes ou por filtração do meio fermentado.
� Pequenas quantidades de águas residuais.
Existem entretanto fatores limitantes nas fermentações no estado sólido, tais
como:
�Menor acessibilidade ao substrato.
� Problemas de transferência de massa (oxigênio e nutrientes), calor e quantida-
de de movimento.
�Dificuldades de controle de variáveis físico-químicas, tais como pH, temperatu-
ra, oxigênio e grau de mistura.
�Dificuldades no aumento de escala.
Diversas enzimas de importância industrial, comoproteases, amilases, glucoamila-
se, celulases, xilanases e pectinases são produzidas por fermentação no estado sólido.
CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 109
1ª prova
Esforços também vêm sendo envidados para a produção de fitase, tanase e esterases,
dentre outras enzimas (KRISHNA, 2005; COUTO e SANROMÁN, 2006).
Dentre osmicrorganismos, os fungos filamentosos, principais produtores de enzi-
mas comerciais, são tambémosmais importantes e os quemelhor se adaptamà fermen-
taçãono estado sólido. Sua formade crescimento emhifas e boa tolerância à baixa ativi-
dade de água e elevada pressão osmótica conferem aos fungos vantagens com relação
aosmicrorganismosunicelularespara a colonizaçãode substratos sólidos. Poucos traba-
lhos foramdesenvolvidos sobre a produção de enzimas por bactérias ou leveduras utili-
zando esta tecnologia. Como exemplos podem ser citados: a produção de alfa amilase
porAeromonas caviae, de celulases porBacilus subtilis e de lipases porCandida rugosa
(KRISHNA, 2005).
Quase todas as enzimas conhecidas e produzidas por outros processos poderiam,
em teoria, ser obtidas por fermentação no estado sólido. Entretanto, e apesar das diver-
sas vantagens citadas acima, esta tecnologia atualmente é muito mais desenvolvida no
mundo oriental.
Controle do bioprocesso
Conforme já mencionado, as enzimas podem sofrer desnaturação quando submetidas
adeterminadas condições ambientais, que variampara cadaenzima.Assim sendo, parâ-
metros operacionais do bioprocesso, tais como pH e temperatura, devem ser rigida-
mente controlados, de formaagarantirnãoapenas amanutençãodas condiçõesótimas
de cultivo do microrganismo produtor, mas também a preservação da atividade
biológica da enzima.
A concentração de oxigênio dissolvido também tem efeitomarcante no crescimen-
to celular e na síntese de enzimas. Amaioria dos processos de produção de enzimas é ae-
róbica,mas emalguns casos a limitação do fornecimento de oxigênio pode ser vantajosa,
como no caso de produção de amiloglucosidase por Aspergilus niger (LAMBERT e
MEERS, 1986). Condições anaeróbicas são utilizadas para a produção da enzima colage-
nase por uma bactéria do gênero Clostridium.
Os processos aerados podem ser conduzidos com aeração natural ou forçada. Na
primeira modalidade, o oxigênio provém do ar ambiente. Grande parte dos processos
conduzidos no estado sólido, descritos anteriormente, é aerado de forma natural.
Nos processos microbianos com aeração forçada em culturas submersas, o ar at-
mosférico esterilizado é borbulhado no seio do meio, onde se dissolve parte do oxigê-
nio que é utilizado pelo agente microbiano. Algumas vezes emprega-se oxigênio puro
ou misturado com ar, o que resulta em aumento na transferência de massa da fase gás
para a fase líquido, com a conseqüente melhoria do processo (AUNINS e HENZLER,
1993; SCHMIDELL et alii, 2001).
O fornecimento de oxigênio a uma cultura em desenvolvimento constitui-se mui-
tas vezes na limitação da tecnologia de produção. É de fundamental importância, por
exemplo, a aeração de processos que utilizam levedurasmetilotróficas para a produção
de enzimas heterólogas (GELISSEN 2000; CEREGHINO e CREGG, 2000).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO110
1ª prova
SEPARAÇÃO, CONCENTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS
As operações que se seguem ao processo fermentativo (downstream) são de extrema
importância devido ao custo substancial de separação, concentração e/ou purificação
das enzimas de interesse tecnológico.Ograudepureza das enzimas comerciais varia de
preparações enzimáticas brutas até altamentepurificadas edependeda sua aplicação fi-
nal. Alémdisso, a escolhadoprocedimentodepurificaçãodependede suaorigem(ani-
mal, vegetal ou microbiana).
Geralmente, as preparações enzimáticas comerciais consistem essencialmente do
sobrenadante da fermentação concentrado, ao qual podem ser misturados aditivos
para estabilizar a atividade enzimática. São removidas, apenas, substâncias que podem
interferir noprocesso ondeobiocatalisador será utilizado. Etapas depurificaçãodesne-
cessárias devem ser evitadas, pois são custosas em termos de equipamento,mãode obra
e perda da atividade enzimática (EUROPEANCOMISSION, 2002). A figura 5.3 ilustra
as etapas envolvidas na recuperação de enzimas e que envolvemprocedimentos especí-
ficos ebrandos emrelaçãoaopH, temperatura e força iônica, adequados àmanutenção
da conformação nativa do biocatalisador e, por extensão, da sua atividade.
CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 111
1ª prova
Figura 5.3 Etapas envolvidas na recuperação das enzimas (GERHARTZ, 1990).
Fermentação
PlantasÓrgãos de animais Microrganismos
Rompimento
Extração
Enzima Intracelular Enzima Extracelular
Rompimento
Filtração
Concentração
Purificação
Secagem
Produto Final
Quando a enzima é de origem animal, como a protease tripsina, os órgãos devem
ser transportados em baixa temperatura, congelados, triturados e as enzimas subse-
qüentemente extraídas comuma solução tampão. No caso de enzimas provenientes de
tecidos vegetais, como papaína e bromelina, omaterial vegetal é triturado e as enzimas
extraídas com o uso de solução tampão (GERHARTZ, 1990).
Etapas iniciais de separação e concentração
A maior parte das enzimas comercializadas industrialmente é extracelular e a primeira
etapaparao isolamentoéa separaçãodas célulasdomeiodecultura.Noentanto, existem
enzimas intracelulares de grande interesse tecnológico e, neste caso, a primeira etapa de
separação envolve a rupturadas células, quepode ser feita utilizando-semétodosmecâni-
cos, como a homogeneização em alta pressão e amoagem úmida. No primeirométodo,
que é omais utilizado, as células são rompidas por forças cisalhantes seguida de simultâ-
nea descompressão do sistema. Pode ocorrer inativação parcial das enzimas devido ao
aquecimento e às fortes forças cisalhantes, devendohaver resfriamento adequadoduran-
te o processo.No caso damoagemúmida, são utilizadas bolas de vidro para a ruptura das
células. Alémdestesmétodos, existemmétodps outros nãomecânicos, emque a ruptura
das células é feita por lise química, térmica ou enzimática (SCHÜTLE e KULA, 1993;
ABRAHÃO NETO, 2001; EUROPEAN COMISSION, 2002).
Após a ruptura das células, a próxima etapa é a separação das enzimas dos fragmen-
tos celulares. Estaoperação, quena indústria é efetuadapor filtraçãocontínua, ébastante
complicadadevidoaopequeno tamanhodos fragmentos celulares eàpequenadiferença
entre a suadensidade e adomeio fermentado.No casode se trabalhar comcélulasmaio-
res, como leveduras, pode-se usar decantação. Osmétodosmais conhecidos para separa-
ção são: centrifugação, floculação, flotação, extração e filtração (GERHARTZ, 1990).
Atualmente, foram desenvolvidas centrífugas eficientes para separar as células e
fragmentos celulares em processo contínuo. A centrifugação tem sido empregada em
grande escala por ser sabidamente ummétodo brando de simples aplicação e de baixo
impacto no rendimento final. O seu custo, no entanto, é relativamente alto e dificil-
mente atinge-se a clarificação desejada da corrente de alimentação. A extensão da apli-
cação das centrífugas dependedo tamanhodapartícula e do conteúdode sólidos. Cen-
trífugas tubulares envolvem forças centrífugasmaiores e podemser utilizadas para sedi-
mentar partículas pequenas,mas não podem ser usadas continuamente. As centrífugascom discos empilhados, também conhecidas como separadores, foram desenvolvidas
para seremusadas continuamente na remoçãodematerial sólidode suspensões.Os de-
cantadores, que trabalhamcombaixa força centrífuga, sãousadosna separaçãodecélu-
las maiores ou de proteínas precipitadas (STEPHANOPOULOS, 1993).
A floculação de células pequenas para a formação de partículas maiores pode ser
obtida pela adição de colóides minerais, sais ou polímeros orgânicos (SANTOS et alii,
1992). Os aglomerados podem ser então removidos por filtração ou por centrifugação.
Senãohouver a formaçãode agregados, as células podemser separadaspor flotação.As
células são adsorvidas em bolhas de gás, levadas ao topo e acumuladas na espuma
(GERHARTZ, 1990).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO112
1ª prova
A extração líquido-líquido em sistema aquoso de duas fases tem sido usada para
isolar enzimas intracelulares. Este método se baseia na mistura incompleta de diferen-
tes polímeros (por exemplo, polietileno glicol (PEG)/dextrana) (ENFORS et alii,
1992) ou de umpolímero comum sal em solução aquosa. A primeira etapa da extração
separa os fragmentos celulares. Este método tambémpode ser utilizado na purificação
de enzimas.
Durante a filtração de suspensões, o aumento da espessura da torta que se forma e
da resistência causam a diminuição do fluxo. Dificuldades adicionais podem surgir de-
vido à compressibilidade domaterial biológico. Os filtros a pressão, por terem uma ca-
pacidade limitada, são geralmente usados na etapa final de filtração de soluções enzi-
máticas. Os filtros a vácuo são normalmente escolhidos devido à compressibilidade do
material biológico. O filtro rotatório a vácuo é muito usado para filtração contínua de
grandes volumes (EUROPEAN COMISSION, 2002).
Recentemente, a filtração em fluxo cruzado (“cross flow filtration”) vem ganhan-
do espaço para a separação (microfiltração) e para a concentração de enzimas
(ultrafiltração).
Na filtração convencional, a soluçãoou suspensão épressionada contra amembra-
na, quedeixapassar o solvente eos solutos dissolvidos.Osmateriais emsuspensão ficam
retidos, acumulando-se na interface damembrana/solução, um fenômeno conhecido
como polarização de concentração. Na filtração em fluxo cruzado, conhecida também
como filtração tangencial, a solução de alimentação escoa tangencialmente pela super-
fície da membrana, enquanto o permeado é transportado transversalmente à mesma.
Neste caso, é possível operar o sistema em regime estabelecido. A polarização de con-
centração continua presente, mas seu efeito é minimizado através da alteração da hi-
drodinâmica de escoamento da corrente de alimentação (HABERT et alii, 1997). Na fi-
gura 5.4 estão representados esquematicamente os dois modos de operação e suas
curvas típicas de fluxo do permeado em função do tempo, mostrando que no fluxo
cruzado pode-se atingir o regime estabelecido.
A microfiltração com fluxo cruzado tem sido bastante mencionada na literatura
(GOKLEN et alii, 1994; SANTOS et alii, 1992; JUNKER et alii, 1993).
Depois da separação, o volume a ser processado é geralmente grande, devendo ser
reduzido por concentração para garantir que se possa posteriormente alcançar uma
purificação economicamente viável. A concentração das enzimas pode ser feita através
de evaporadores a vácuo, por precipitação ou por ultrafiltração, em condições brandas
que não levem à inativação das enzimas. A precipitação é um procedimento simples
para a concentração de enzimas que pode ser efetuada por adição de sais, solventes or-
gânicos, soluçõesdepolímeros oupor alteraçãodopH.Noentanto, aprecipitaçãoége-
ralmente utilizada empequena escala porquequandoo volume a ser processado émui-
to grande, o tempo de residência necessário é extremamente longo, especialmente no
caso de solventes orgânicos, podendo resultar na inativação das enzimas (GERHARTZ,
1990).
CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 113
1ª prova
A ultrafiltração representa técnica atrativa para a concentração de enzimas e sua
purificaçãoprimária (KRSTIC et alii, 2007). A seletividade é definida pela relaçãode ta-
manho entre as espécies presentes e os poros da membrana. A enzima que se deseja
concentrar deve ser inerte em relação aomaterial da membrana e o fluxo permeado é
fundamentalmente convectivo devido à força motriz que é o gradiente de pressão. O
processo de ultrafiltração é ummétodo comercialmente viável comuma alta produtivi-
dade, alémdeoferecer umapureza razoável. Adicionalmente, é extremamente simples
do ponto de vista operacional e de escalonamento, por possuir sistemas modulares de
fácil operação (LI et alii, 2006).
Durante a concentração por ultrafiltração, independentemente da operação ser
do tipo convencional ou tangencial, a concentração do soluto na interface membra-
na/soluçãoaumenta, já queamembranaé, supostamente, seletivaparao soluto. Imedi-
atamente inicia-se uma retrodifusão deste soluto emdireção ao seio da solução, estabe-
lecendo-se um perfil de concentração do soluto nas proximidades da interface mem-
brana/solução. Este fenômeno, que é conhecido comopolarização da concentração, é
reversível e se estabelece rapidamente podendo provocar uma queda inicial acentuada
do fluxodopermeado.Alémdisto, podeocorrer quedado fluxodevido aproblemasde
adsorção do soluto namembrana e eventual entupimento dos poros, fenômenos geral-
mente irreversíveis, conhecidos como fouling (GOTTSCHALK, 2002). Esta queda no
fluxo do permeado devido à polarização da concentração e ao “fouling” tem uma in-
fluência negativa na viabilidade econômica do processo commembrana, e por esta ra-
zão,medidas devem ser tomadas paraminimizar sua incidência. Tanto a polarização da
concentração quanto o “fouling” dependem fortemente das condições operacionais e
da característica damembrana, como as propriedades da alimentação, pesomolecular
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO114
1ª prova
Figura 5.4 Filtração convencional x Filtração tangencial (GOTTSCHALK, 2002).
Filtração Convencional Filtração Tangencial
Tempo
Fluxo
Tempo
Fluxo
decorteou cutoff, pressão transmembranaea velocidadedeescoamento tangencial da
alimentação (LIet alii, 2007). Paraumamesmapressãodeoperação, quantomaior a ve-
locidade de escoamento tangencial da alimentação menor será a polarização de con-
centração (HABERT et alii, 1997).
Diversos trabalhos na literatura utilizam a ultrafiltração para concentrar enzimas
(ROSEIRO et alii, 1993; GOTTSCHALK, 2002; TAKAC et alii, 2000; KRSTIC et alii,
2007; LI et alii, 2006) eparapurificar enzimas emassociação aoutrosmétodosdepurifi-
cação (BÔERet alii, 2006;RIDGWAYeTUCKER, 1999; SRINIVASet alii, 2002; PARKet
alii, 1997; IVANOV et alii, 1996; GAWANDE e PATKAR, 2001).
A diafiltração consiste na operação dos processos de micro ou ultrafiltração com
uma alimentação contínua de solvente em vazão igual a do permeado. Trata-se em reali-
dade de uma operação de lavagem da solução problema. É bastante utilizada quando se
deseja purificar um determinado soluto de uma solução na qual os contaminantes são
compostos comdimensõesmenores do que a do soluto de interesse (CASTRO-OCHOA
et alii, 2005).
Na literatura já foram citadosmais de 130materiais utilizados para a fabricação de
membranas, no entanto, apenas alguns desses materiais alcançaram uso industrial e
poucos tiveram aprovação para aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e de
produtos infantis. Existem três polímeros principais utilizados para fabricação demem-
branas utilizadas para microfiltração e ultrafiltração: acetato de celulose, poliamida e
polissulfona (CHERYAN, 1998). Recentemente, o uso de membranas cerâmicas tem
sido investigado na biotecnologia devido a sua resistênciamecânica, térmica e química
(KRSTIC et alii, 2007).
Purificação de enzimas
Preparações enzimáticas parcialmente purificadas são suficientes para diversasaplica-
ções industriais. No entanto, para uso medicinal e analítico ou para aplicação em pes-
quisa, as enzimas devem ser extremamente puras, chegando, em alguns casos, emnível
dehomogeneidadeprotéica. Procedimentos especiais, tais comocristalização, eletrofo-
rese, diferentes tipos de cromatografia, extração líquido-líquido e fracionamento com
espuma, sãoutilizados parapurificaçãode enzimas, (SÁ-PEREIRA et alii, 2003;UHLIG,
1998). Esses procedimentos implicam, em geral, custos bastante elevados,
As enzimas podem ser concentradas por cristalização usando-se sais, como o sulfa-
to de amônio, ou solventes orgânicos, como etanol e acetona, mas geralmente a prepa-
ração final não apresenta alta pureza, o que limita o uso deste método (JESUS et alii,
1999; PARK et alii, 1997).
Já a eletroforese, em que a diferença da mobilidade das proteínas é imposta por
um campo elétrico, é usada apenas em laboratório pois o calor gerado durante o pro-
cesso e a interferência causada pela convecção são problemas associados ao escalona-
mento deste método (GERHARTZ, 1990; SÁ-PEREIRA et alii, 2000).
A cromatografia é uma técnica de fundamental importância para a purificação de
enzimas, que podem ser separadas de acordo com o seu tamanho, forma, carga, hidro-
CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 115
1ª prova
fobicidade e afinidade bioespecífica. A separação cromatográfica é baseadanadistribu-
ição dos componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel.
Na cromatografia de peneiramolecular ou cromatografia de exclusão, as molécu-
las de proteínas são separadas pelo seu tamanho e forma. Estemétodo trabalha comvo-
lumes pequenos de soluções previamente concentradas, pois a capacidade máxima da
coluna é de 10% do seu volume. É comercialmente usada para separação e desaliniza-
ção de soluções enzimáticas (GERHARTZ, 1990; IVANOV et alii, 1996; GAWANDE e
PATKAR, 2001).
Na cromatografia de troca iônica, a separaçãobaseia-se na carga líquidadas proteí-
nas presentes emumamistura. A carga é influenciada pelo pHe esta propriedade é uti-
lizada para separar as espécies protéicas. A capacidade de processamento de volumes
maiores de amostras diluídas torna este método bastante útil para aplicação industrial,
desde que se disponha de umamatriz de troca iônica comboa resolução, com altos flu-
xos e resistente ao gradiente salino e à mudança de pH (ABRAHÃO NETO, 2001;
EUROPEAN COMISSION, 2002).
A cromatografia por interação hidrofóbica baseia-se na interação das regiões hi-
drofóbicas das proteínas com os grupos hidrofóbicos da matriz. A adsorção ocorre em
altas concentrações salinas e o fracionamento é alcançado comumgradiente salino ne-
gativo. Este método é ideal para a purificação de enzimas que foram concentradas por
precipitação com sulfato de amônio (GERHARTZ, 1990).
A cromatografia de afinidade, por sua vez, baseia-se na ligação bioespecífica da en-
zimacomligantespresentesno suporteda coluna, quepodemser substratosou inibido-
res. A enzimade interesse é posteriormente recuperadapor eluição comsoluçãodepH
ou força iônica adequados. A despeito de sua seletividade muito elevada, essa técnica
tem aplicação restrita à escala de laboratório ou a segmentosmuito específicos, como o
caso das enzimas analíticas (SANT’ANNA, 2001).
A cromatografia de imunoafinidadeocupaum lugarúnicona tecnologiadepurifi-
cação pois utiliza anticorpos monoclonais que interagem especificamente com a enzi-
ma a ser purificada (GERHARTZ, 1990).
Aextração líquido-líquidopermite apurificaçãodasenzimasprovenientesdecaldos
fermentativos oudehomogeinadosde células (SRINIVASet alii, 2002;DASILVAeLOH,
2006). A partição bifásica aquosa utiliza as propriedades das soluções de dois polímeros
oudeumpolímeroedeumsalde se separarememduas fases aquosasquandocertas con-
centrações mínimas são excedidas. As duas fases aquosas assim formadas apresentam
composição diferente, cada uma delas enriquecida em um dos constituintes do sistema,
istoé,osdoispolímeros, ouopolímeroeo sal, concentram-seemfasesdistintas.O teorde
água destas fases é usualmente superior a 80%, podendo em alguns casos atingir valores
superiores a 95%.Os sistemas bifásicos aquosos apresentam, portanto, ambientes suaves
para moléculas e partículas biológicas (XU et alii, 2003; BANIK et alii, 2003).
Uma análise econômica sugere que a extração líquido-líquido pode ser favoravel-
mente competitiva com as tecnologias já estabelecidas e com as vantagens de escalona-
mento fácil, rapidez na purificação e alta seletividade (STEPHANOPOULOS, 1993).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO116
1ª prova
O fracionamento com espuma, uma técnica de separação com bolhas adsortivas,
pode ser empregado como ummétodo adicional de purificação de enzimas ou até mes-
mo substituir as operações cromatográficas. Especial atenção deve ser dada ao ajuste dos
principais parâmetros que afetam a distribuição da enzima na espuma, como pH, con-
centração da enzima e do detergente, velocidade superficial e tempo de formação de es-
puma. Resultados recentes refutaram a hipótese que processos comespuma obrigatoria-
mente vem acompanhados de perda da atividade enzimática (LINKE et alii, 2007).
Etapas finais de acabamento
As preparações enzimáticas, brutas ou purificadas, devem manter as suas características
de catalisador durante o armazenamento e comercialização até a sua aplicação, pois as
enzimas são comercializadas com base na sua atividade catalítica. O fabricante normal-
mente indicaas condiçõesdearmazenamentoeavalidadedaatividadenestas condições.
Amaioriadaspreparações enzimáticas industriais contém, alémdaenzimaativa, ou-
tras proteínas, estabilizantes, preservativos, sais e um diluente que permite a padroniza-
ção entre as produções obtidas de diversas bateladas com diferentes atividades específi-
cas. Para amanutenção da atividade enzimática é fundamental a preservação de sua con-
formação nativa, sendo utilizados, para esta finalidade, aditivos, modificação química
controlada ou imobilização enzimática.
A estrutura das proteínas pode ser estabilizada em soluções de força iônica deter-
minada de sais neutros, como sulfato de amônio e fosfato de potássio. Adicionalmente,
altas concentrações de cloreto de sódio (20%) impedemo crescimentomicrobiano de-
vido ao efeito osmótico. Polióis de baixo pesomolecular comoglicerol, sorbitol emani-
tol também estabilizam as enzimas e reprimem o crescimento microbiano devido à re-
dução da atividade da água (EUROPEANCOMISSION, 2002). Além disso, várias enzi-
mas podem sermantidas na forma liofilizada por longos períodos de tempo na presen-
ça de estabilizadores, como sais, carboidratos ou proteínas inertes, predominantemen-
te albumina bovina sérica (BSA) (GERHARTZ, 1990). Outras substâncias que podem
ser adicionadas às preparações de enzimas para sua estabilização incluem: substratos,
tióis para manter o ambiente redutor, antibióticos, ésteres de ácidos benzóicos como
preservativos de preparações enzimáticas líquidas, inibidores de enzimas contaminan-
tes e agentes quelantes.Os aditivosdevemser compatíveis comouso final da enzimaem
questão. A maioria das preparações enzimáticas é comercializada na forma líquida ou
granulada e os detalhes da metodologia empregada na estabilização somente são
revelados a clientes quando necessário como informação confidencial (EUROPEAN
COMISSION, 2002).
PERSPECTIVAS
A aplicação de técnicas de biologia molecular tem contribuído fortemente para a ex-
ploração de novas enzimas e o desenvolvimento de novas propriedades enzimáticas e
certamente continuará a impulsionar o desenvolvimento na área de produção de enzi-
CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 117
1ª prova
mas (OLEMPSKA-BEER et alii, 2006; EUROPEAN COMISSION, 2002; ADRIO, 2003;
PENG, 2005; OLEMPSKA-BEER, 2006; ANTRANIKIAN, 2005).
O uso dessas novas tecnologias permite aumentos substanciais nos rendimentose
produtividades enzimáticos atravésdousode sistemasdeexpressãoeficientesouqueper-
mitam a inserção demulticópias de genes. Assim, novas enzimas, ainda não acessíveis an-
teriormente, podem ter seus genes clonados e serem produzidas em microrganismos
hospedeiros de fácil cultivo em grande escala. Nesse contexto, são de especial importân-
cia as chamadas extreomozimas, biocatalisadoresnaturalmenteestáveis emcondições ex-
tremas de pH, temperatura e salinidade, obtidos a partir de organismos extremófilos.
Métodosmodernos de engenharia de proteínas e de evoluçãomolecular têm per-
mitido, por sua vez, o aprimoramento de propriedades de uma dada enzima, tais como
estabilidade,mecanismos catalíticos, tipo e especificidadede substrato, atividade super-
ficial, dependência de cofator, pH e temperatura ótimos e parâmetros cinéticos.
A biossegurança da produção de enzimas deve também ser melhorada através da
restrição dosmicrorganismos produtores para poucas espécies bem conhecidas e segu-
ras, empregadas como hospedeiras para genes de diversas fontes. Entretanto, a produ-
ção de enzimas por microrganismos melhorados por genética clássica continuará a ter
um papel fundamental na produção de biocatalisadores.
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