SILENCIAMENTO DA EXPRESSÃO GÊNICA PÓS TRANSCRICIONAL SAROCHIM

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL 
CÂMPUS DE AQUIDAUANA 
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
Anderson Sarochim Franco 
Mateus Dias Gomes 
 
 
 
 
 
SILENCIAMENTO DA EXPRESSÃO GÊNICA PÓS-TRANSCRICIONAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aquidauana - MS 
Novembro/2014 
 
Anderson Sarochim Franco 
Mateus Dias Gomes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SILENCIAMENTO DA EXPRESSÃO GÊNICA PÓS-TRANSCRICIONAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
Trabalho apresentado na disciplina de 
Bioquímica, da Fundação Universidade 
Federal de Mato Grosso do Sul, Curso 
de Ciências Biológicas/Licenciatura, 
Profª. Drª. Alice Maria Derbócio. 
 
 
 
 
 
Aquidauana - MS 
Novembro/2014 
 
Silenciamento da expressão gênica pós-transcricional 
 
O processo de silenciamento gênico ocorre naturalmente em todos os seres 
eucariotos, como um mecanismo conservado de regulação da expressão gênica, 
envolvido no sistema de defesa dos organismos (BAULCOMBE, 1999 apud 
BARBOSA & LIN, 2004). Desta forma, seriam identificados e inabilitados RNAs não 
reconhecidos, como o de parasitas moleculares (transposons e vírus), ao 
transcriptoma celular sinalizando-os como perigo ou alerta (AGRAWAL et al., 2003). 
Os estudos com a molécula de RNA são recentes, na década de 1980 
descobriu-se que o RNA tem função catalítica, como as enzimas (MENCK, 2010). Mas 
os primeiros indícios do silenciamento foram observados na década de 1990, quando 
resultados com plantas transgênicas geraram dados imprevistos, onde o objetivo era 
aumentar a expressão do gene responsável pela produção de antocianinas (proteínas 
associadas a pigmentação violeta-escuro em petúnias) introduzindo cópias adicionais 
de homólogos deste gene. O resultado foram petúnias variegadas ou totalmente 
brancas. O motivo foi o inesperado bloqueio da expressão do gene endógeno 
causando ausência da síntese do pigmento. Este fenômeno na época foi denominado 
de “co-supressão” (NAPOLI, 1990). 
Até então, o mecanismo que levava ao silenciamento gênico era desconhecido. 
Em 1993 os microRNAs ou miRNAs foram pela primeira vez relatados (LEE, 2001 
aput GOMES, 2008). Mas só em 1998 o termo “Interferência por RNA” foi utilizado 
pelos pesquisadores americanos Andrew Z. Fire e Craig C. Mello estudando o verme 
nematoide Caenorhabditis elegans. Ao analisarem o efeito da interferência gênica 
com a introdução de RNA fita simples antissenso e também senso (em relação ao 
sentido da molécula do RNA mensageiro do gene-alvo) e RNA dupla fita (dsRNA – 
double stranded RNA), o resultado foi que as moléculas de dsRNA tinham um efeito 
cem vezes maior no silenciamento da expressão de genes (MENCK, 2010). Pela 
participação na elucidação do processo de regulação gênica mediado por RNA 
interferente os doutores Fire e Mello receberam o Prêmio Nobel de Medicina e 
Fisiologia em 2006 (FIRE et al., 1998). 
Fazem parte deste mecanismo regulatório diversas classes de pequenos RNAs 
que não codificam proteínas, estes podem ser basicamente classificados de acordo 
com sua origem e função em três categorias: miRNAs (microRNAs), siRNAs (short 
interfering RNAs) e shRNAs (short hairpin RNAs) (MEISTER & TUSCHL, 2004 aput 
FRANÇA et al., 2010). 
A biogênese e caracterização dos principais constituintes da maquinaria de 
silenciamento gênico atualmente é bem conhecida (MENCK, 2010). Os miRNAs são 
de origem endógena transcritos pela RNA polimerase II ou RNA polimerase III (em 
mamíferos). Um longo transcrito de miRNA primário (pri-miRNA) é gerado contendo 
uma ou mais estruturas em forma de grampo. Ainda no núcleo acontece a primeira 
clivagem do pri-miRNA por um complexo enzimático composto pela enzima DROSHA 
(um tipo de RNase III), pela proteína DGCR8 (do inglês DiGeorge syndrome critical 
region gene 8) e por uma variedade de cofatores. A clivagem forma o microRNA 
precursor (pre-miRNA) com aproximadamente 70 nucleotídeos, contendo um trecho 
de fita dupla e uma alça de fita simples, formando uma estrutura denominada hairpin, 
do processamento pelo complexo DROSHA (o microprocessamento por este 
complexo não é obrigatório). Quando alguns pri-miRNAs intrônicos, após o processo 
de splicing, apresentam um tamanho apropriado e uma conformação de grampo 
similar a um pre-miRNA, a clivagem pela DROSHA é ignorada e são levados 
diretamente ao citoplasma (BARTEL, 2004). 
O pré-miRNA é transportado ao citoplasma pela exportina-5 (Exp5), uma 
proteína que necessita do cofator Ran-GTP para exportação nuclear, então o pre-
miRNA é clivado pela enzima Dicer (RNase III), formando um RNA de dupla fita de 19 
a 23 nucleotídeos (SCHWARZ et al., 2003). A Dicer é uma RNase III que está também 
envolvida na incorporação de uma das fitas do miRNA a um complexo denominado 
RISC (RNA-Induced Silencing Complex) do qual faz parte juntamente com Argonauta 
(Ago2) e outras proteínas (RICARTE FILHO & KIMURA, 2006). Após a incorporação 
do miRNA maduro no complexo RISC apenas uma das fitas do duplex de miRNA 
permanece no complexo para controlar a expressão pós-transcricional no RNAm-alvo, 
estudos indicam que a fita incorporada é aquela que possui o terminal 5’ (SCHWARZ 
et al., 2002). A degradação ou inibição traducional do RNAm-alvo depende do grau 
de complementaridade dos seus pares de bases com os pares do miRNA incorporado 
no complexo RISC (RICARTE FILHO & KIMURA, 2006). 
As Argonautas, proteínas presentes no complexo RISC, se ligam aos siRNA e 
miRNA e caracterizam atividade de endonuclease dirigida contra a fita de mRNA 
complementar ao siRNA ou miRNA, pela presença de domínios conservados. São 
também responsáveis pela seleção da fita do siRNA, que será incorporada ao RISC 
(RAND et al., 2005; HÖCK & MEISTER, 2008 apud FRANÇA et al., 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 1: Esquema simplificado mostrando o mecanismo de silenciamento gênico. A) 
Síntese e ação do miRNA, desde a sua transcrição até a degradação ou bloqueio do RNAm 
alvo. B) Esquema mostrando a interferência de forma dirigida, empregada pela utilização de 
siRNA e shRNA. 
Fonte: MENCK (2010). 
 
Os shRNAs podem ser sintetizados exogenamente e introduzidos prontos na 
célula ou transcritos dentro da célula a partir de vetores que codificam o shRNA junto 
a um promotor da RNA polimerase III. São construídos para serem semelhantes à 
estrutura dos miRNAs inclusive são processados pela Dicer da mesma forma que os 
miRNAs (PADDISON et al., 2002). 
Os siRNAs atuam de maneira específica, são moléculas sintéticas de dupla fita 
de RNA de 19 a 30 nucleotídeos. O pareamento das sequencias complementares ao 
RNA mensageiro alvo causa a sua degradação, em consequência o silenciamento 
A 
B 
específico do gene (MORRIS et al., 2004 apud FRANÇA et al., 2010). A possibilidade 
de obter informações sobre a função exercida na célula pela proteína que esse gene 
codifica tem sido considerado um método altamente promissor no combate a doenças 
como o câncer, doenças genéticas dominantes, doenças autoimunes e infecções 
virais (AAGAARD & ROSSI, 2007 apud FRANÇA et al., 2010). 
O método que utiliza shRNA e siRNA é chamado de Interferência por RNA 
(RNAi) e atualmente as mais avançadas companhias de biotecnologia estão 
dedicadas ao desenvolvimento de aplicações clínicas de RNAi em várias doenças 
humanas, utilizando inclusive análises bioinformáticas (FRANÇA et al., 2010). 
Os microRNAs possuem uma relação muito íntima com o sistema imunológico, 
sendo que os microRNAs regulam negativamente as vias de sinalização de receptores 
Toll-like e de citocinas, ao passo que outros microRNAs podem ativarreceptores Toll-
like (HORNUNG et al., 2005). 
Os oligonucleotideos anti-microRNAs são constituídos de pequenas moléculas, 
que possuem o mesmo tamanho dos MicroRNAs, que são quimicamente alterados 
para alcançar uma estabilidade maior e assim serem introduzidas no corpo humano 
para tentar inibir a ação de um microRNA especifico (ESAU, 2008 apud BATISTA & 
VERBISCK, 2009). 
Ao longo dos últimos anos, diversos métodos estão sendo implementados com 
base em ácidos nucleicos antisenso para modular ou até inibir a função alterada dos 
MicroRNAs, aumentando novas possibilidades terapêuticas de grande potencial para 
doenças como câncer e diabetes (ESAU, 2008 apud BATISTA & VERBISCK, 2009). 
 
Figura 2: Moléculas de RNA e seus congêneres de oligonucleotideos com modificação 2’-O-
metil(2’-OMe),2’-O-metoxietil(2’-O-MOE) e do tipo ácido nucléico fechado (LNA). 
Fonte: BATISTA & VERBISCK (2009) 
Os microRNAs estão oferecendo boas perspectivas como biomarcadores para 
diagnóstico, prognóstico, progressão e resposta ao tratamento de câncer (LU et al., 
2005) 
A relação do microRNA com o câncer é devido também ao fato de que nos 
humanos mais de 50% dos genes de microRNAs estão localizados em regiões 
genômicas que tem uma alta associação com o câncer ou em sítios frágeis (CALIN et 
al., 2003) 
Com algumas técnicas e análises moleculares, como por exemplo a análise por 
Northern-blot, RT-PCR e microarranjos de microRNA, foi possível detectar altos e 
baixos níveis de expressão de microRNAs específicos. Estas técnicas são utilizadas 
por equipes que vêm estudando os microRNAs, permitindo chegar à conclusão de que 
os microRNAs estão envolvidos no câncer humano (ZHANG et al., 1997). 
Outros tipos de sequência de RNAs são o shRNA( small hairpin RNA) e o 
siRNA( small interfering RNA). Os shRNAs são RNAs de dupla fita construídos para 
apresentarem uma estrutura parecida com microRNAs. Podem ser sintetizados 
exogenamente e introduzidos já prontos na célula ou também transcritos dentro da 
mesma partindo de vetores que codificam o shRNA junto a um promotor da RNA 
polimerase III. Nesse caso o transcrito é processado pela Dicer da mesma forma que 
os microRNAs (PADDISON,2002). Já os siRNAs são moléculas sintéticas de dupla 
fita de RNA de 19 a 30 pb, que agem através de pareamento a sequências 
complementares ao RNA mensageiro alvo, causando assim sua degradação e, 
portanto, silenciamento específico do gene. Com o silenciamento do gene-alvo as 
possiblidades de obter informações sobre a função exercida na célula pela proteína 
que esse gene codifica são muito maiores (KEVIN & MORRIS et al., 2004). 
Em uma outra abordagem, com a descoberta do processo de regulação gênica 
por meio de RNA interferência a forma de estudar o papel de genes específicos sofreu 
uma grande revolução. A utilização de moléculas de RNAdf(RNA dupla fita) exógenas 
como ferramenta pode reduzir a expressão de genes específicos (efeito conhecido 
como knock-down), sendo que as mudanças causadas por essa estratégia aumenta 
as possibilidades de avaliar quais funções esse gene desempenha na célula. Nesses 
experimentos, a sequência da molécula de RNAdf é definida pelo pesquisador para 
interferir no seu gene-alvo selecionado. Essa estratégia também pode ser usada 
diretamente in vivo (em animais ou em humanos) possibilitando o desenvolvimento de 
fármacos (TIEMANN & ROSSI, 2009 apud MENCK, 2010). 
Para Sing & Gaur (2009 apud MENCK, 2010) o potencial terapêutico de 
silenciamento através de RNA tem sido estudado e investigado tendo como alvo 
vários tipos de doenças, como câncer, doenças respiratórias, inflamação, doenças 
neurológicas, autoimunes e no combate a processos de infecção (Figura 3). 
Os testes com animais aplicam siRNA ou shRNA através de várias vias de 
administração, dependendo do gene e do tecido-alvo. Por exemplo, aplicações 
intravenosas possibilitam que a duplex seja direcionada ao fígado, onde vai para o 
interior das células. Já a introdução de siRNA por injeção intraocular garante um efeito 
direto no olho, com a vantagem de que esse órgão é um compartimento com limite de 
tamanho, possibilitando o uso de poucas moléculas, que ainda são efetivas no 
silenciamento gênico (ELBASHIR et al., 2001 apud MENCK, 2010). 
 
Figura 3 – Principais vias utilizadas para silenciamento gênico através de ação direta em 
Protocolos humanos com RNA interferência. 
Fonte: MENCK (2010) 
 
Existe duas estratégias básicas para se induzir RNAi. Na primeira, siRNAs pré-
sintetizados são introduzidos nas células-alvo. Embora várias estratégias empreguem 
siRNAs de 21-23 pares de base, siRNAs mais longos, com 27 nucleotídeos(nt), que 
são processados pela Dicer, são mais eficientes em promover o silenciamento. Esses 
siRNAs mais longos possuem uma extremidade 3’ com 2nt que não são pareados e 
uma extremidade cega (blunt end) permitindo que o processamento pela Dicer tem 
como resultado um único siRNA. De maneira eventual, a extremidade cega pode 
ativar proteínas sinalizadoras e induzir a produção indesejada de interferon por vias 
de resposta ao estresse, no entanto, por ser mais potente, os siRNAs de 27nt podem 
ser utilizados em doses menores, evitando esse efeito (KIM & ROSSI, 2007 apud 
FRANÇA et al., 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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