HBV e HCV

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HBV e HCV
Camila Gomes Janeri  Eduarda Lencina Matos  Filipe Euclides Gobatto  Filipe Osni Coelho  Leonardo Demartini Freschi  Priscila Visnieski Zenerato
Roteiro
HBV:
Problemática;
Patogênese;
Transmissão;
Profilaxia;
Diagnostico de biologia molecular;
Tratamento.
HCV:
Problemática;
Patogênese;
Transmissão;
Profilaxia;
Diagnostico de biologia molecular;
Tratamento.
HBV
I. Problemática
Doença causada pelo Vírus da Hepatite B (HBV);
Bilhões de pessoas já tiveram contato com o vírus;
Milhões são portadores crônicos;
Doença Sexualmente Transmissível;
Forma ictérica: apenas 30% dos indivíduos infectados a desenvolvem comprovada cientificamente;
I. Problemática
Forma crônica:
Adultos: 5 a 10% desenvolvem;
Recém nascidos: 70 a 90% das infectadas por transmissão vertical;
10 a 40% não possuem replicação do vírus.
Crianças (-5 anos): 70 a 90% desenvolvem.
20 a 25% dos casos crônicos com replicação viral desenvolvem doenças hepáticas avançadas (cirrose e hepatocarcinoma)
Vírus da hepatite B
Tamanho: 42 nm;
Envelope: HBsAg, proteína L e M;
Core ou nucleocapsideo: HBcAg, HBeAg,
Genoma: DNA circular dupla fita incompleta;
DNA polimerase
II. Patogênese
O HBV tem predileção pelos hepatócitos;
Processo inflamatório crônico: causado pelas células do sistema imune;
Período de incubação: 1 a 4 meses;
O individuo pode desenvolver:
Hepatite aguda;
Hepatite crônica;
Hepatite fulminante.
II. Patogênese
Sintomas:
Hepatite B aguda:
Mal estar, perda de apetite, fadiga, dor, náuseas, epigástrica, edema.
Hepatite B crônica:
Icterícia, aumento do baço (esplenomegalia), acúmulo de líquido na cavidade abdominal (ascite), distúrbios de atenção e de comportamento (encefalopatia hepática).
Hepatite B fulminante:
Icterícia, colúria, distúrbios do sono, voz empastada e raciocínio lento.
mal estar, dores articulares e fadiga, icterícia (amarelão), náuseas e falta de apetite
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III. Transmissão
Via vertical:
Durante ou após o parto.
Via horizontal:
Pequeno ferimentos na pele e mucosas;
Compartilhamento de agulhas e seringas;
Transfusão de sangue;
Relações sexuais.
IV. Profilaxia
Utilizar preservativo;
Vacinação.
Devem ser vacinados
Recém-nascidos, crianças que não foram vacinadas ao nascer, pessoas com vida sexual ativa, aquelas que convivem com pacientes com a enfermidade ou necessitam de transfusões de sangue com frequência, as submetidas à hemodiálise, usuários de drogas injetáveis, os profissionais na área de saúde, os doadores de órgãos sólidos e de medula óssea, policiais, manicures, podólogos, portadores de HIV e de imunodeficiências, vítimas de abuso sexual e a população indígena.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
PCR Nested:
Primeira ampliação (abrangente):
Primers externos: MDD2 e HDM3;
Solução: 50 ml com 16 miliM (NH4)2SO4, 1,5mM MgCl2, 67mM Tris-HCl (pH 8,8 à 25°C), 200nM dNTP mix, 200pmol de “primers” externos, 1,25 U de enzima Super-Therm DNA polimerase e 10 micro litro de cada diluição viral extraída;
33 ciclos
T1: 94º C, 1’40’’;
T2: 50º C, 30”;
T3; 72º C, 30”.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
PCR Nested:
Segunda ampliação (sequencia alvo):
Primers internos: MDN5 e HDB2;
Solução: idêntica a primeira, entretanto com um volume de 24ml de primers internos e com um novo DNA alvo: 2mL do segmento ampliado obtido na primeira reação de PCR;
T1: 94º C, 40” + uma extensão de 30” a 94º C
T2: 50º C, 30”;
T3: 72º C, 30”
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
PCR Nested:
Analise:
Gel de eletroforese;
Gel de agarose 2%;
EtBr: 0,5 mg/ml;
Se for constatada a presença da sequencia de DNA viral do HBV o indivíduo esta infectado.
PCR Nested analise
Controle positivo (377 pb)
Controle negativo
Diluição 1000 Cópias/mL (377 pb)
Diluição 750 Cópias/mL (377 pb
Diluição 500 Cópias/mL (377 pb)
Diluição 250 Cópias/mL 
Marcador peso molecular (100 pb).
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
PCR Qualitativo:
Enzima transcriptase reversa;
Amplificar DNAc;
Produtos para ampliação: Triton X-100, dATP, dCTP, dGTP, e dTTP, e 5 U de TaqADN polimerase;
Primers do HBV: iniciador 176 e iniciador 178;
Primers exteriores: 409 e 656;
Iniciadores internos: 252 e 687;
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
PCR Qualitativo:
35 ciclos durante o ensaio;
Temperatura de hibridização: 57 º C;
A PCR é pré- aquecida a 95 C;
Temperatura de desnaturação: inicial a 95 ° C para 3 minutos e extensão final de 72º C durante 3 min;
Cada ciclo consisti de 1 minuto a 95º C, 1 minuto a 72º C;
É um teste sensível ao DNA do HBV.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Carga viral do HBV:
Aplicação:
Quantificar vírus HBV circulante;
Acompanhamento de pacientes submetidos a tratamento antiviral;
Detecção do nível de replicação viral em pacientes HBsAg positivos com:
mutação pré-core (HbeAg negativos, Anti-HBe positivos);
persistência da viremia
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Carga viral do HBV:
Metodologia:
Material: plasma (EDTA) ou soro;
O volume da amostra comumente utilizado tem o valor de 2 ml (tubo primário);
Congelar após a coleta por 6 meses no máximo a -20 º C;
. A técnica utilizada é o PCR em Tempo Real;
A faixa dinâmica de detecção se apresenta entra 50 a 190 UI/ml;
Cabe ressaltar que o paciente ao fazer o exame deve informar as medicações previamente utilizadas.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Hepatite B Genótipo resistência genotípica:
Aplicação:
Identificar o genótipo do Vírus da Hepatite B (A-H) e também para a determinação da resistência aos diversos antivirais;
Detectar mutações relacionadas à diminuição de susceptibilidade a estes medicamentos.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Hepatite B Genótipo resistência genotípica:
Metodologia:
O exame assemelha-se aos citados anteriormente;
PCR + sequenciamento;
O limite inferior de detecção:200 UI/ml.
VI. Tratamento
Moderar atividade física;
Não consumir álcool ou fazer uso de qualquer substancia que agrida o fígado;
Não a consenso sobre uso de medicamentos;
Se for necessário deve-se fazer uso de medicamentos anti inflamatórios.
HCV
I. Problemática
Doença causada pelo Vírus da Hepatite C;
No Brasil há cerca de 3 milhões de infectados;
O portador pode desenvolver hepatocarcinoma e cirrose;
Não há vacina.
I. Problemática
Risco de infecção:
ALTO: Usuários de drogas injetáveis e pessoas que receberam fatores de coagulação antes de 1987;
INTERMEDIÁRIO: Pacientes de hemodiálise; pessoas que receberam sangue/órgãos antes de 92 ou com problemas hepáticos não diagnosticados; crianças nascidas de mães infectadas;
BAIXO: Pessoas que trabalham em hospitais, clínicas;múltiplos parceiros sexuais ou com parceiro fixo infectado;
Vírus da Hepatite C
Tamanho: aproximadamente 50 nm;
Genoma: RNA
Local de reprodução: citoplasma e RE;
Envelope: bilipídico;
Produz enzimas que inibem a apoptose e o interferon
II. Patogênese
O HCV tem predileção pelos hepatócitos;
Período de incubação: 8 a 12 semanas;
Mesmo sem apresentar sintomas o individuo é capaz de transmiti-lo;
A presença por mais de 6 meses do RNA desse vírus após a infecção caracteriza a forma crônica dessa doença.
II. Patogênese
Hepatite aguda:
Sintomas típicos em 1/3 dos pacientes
Altos níveis de ALT (10x) em 80% dos infectados
Resolução em 2-12 semanas
Hepatite crônica:
Ocorre em 50-80% dos pacientes (persistência)
Maioria são assintomáticos - fonte de infecção 
Suscetíveis a cirrose e carcinoma hepatocelular
Detecção de lesões hepáticas após 10-29 anos
III. Transmissão
Via vertical:
Ocorre em até 35% dos partos de mães infectadas.
Via horizontal:
Compartilhamento de agulhas e seringas;
Hemodiálise.
IV. Profilaxia
Não compartilhar agulhas e seringas;
Utilizar preservativo.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Teste qualitativo:
Extremamente sensível;
Baixo custo;
1 em cada 10 testes pode ter seu resultado errado, poisé um teste de grande complexidade na execução
Em todos os testes do SAE é utilizado um controle interno;
Limite de detecção: 50 UI/ml ou 135 cópias/ml;
V. Diagnósticos de Biologia Molecular
Teste qualitativo:
Indicado para diagnostico de HCV nos seguintes casos:
Pacientes com sorologia positiva ou indeterminada (Elisa); 
Pacientes com antecedentes de uso de drogas endovenosas; 
Profissionais de Saúde após exposição ocupacional; 
Crianças nascidas de mães HCV positivas; 
Pacientes que sofrem hemodiálise; 
Pacientes transfundidos antes de 1992; 
Pacientes com elevação persistente de ALT (Alanina Aminotransferase) acima de uma vez e meia o limite superior de referência nos últimos seis meses; 
Pacientes imunossuprimidos; 
Para avaliação da resposta à terapia e cura em casos de Carga Viral abaixo do limite de detecção. 
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Pré-tratamento
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V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Teste quantitativo carga viral:
Ampliador monitor – Roche;
Não é um teste para diagnóstico;
E sim, para decidir sobre instituição e duração de uma terapia;
Assim como, no monitoramento da terapia antiviral e na resposta virológica sustentada.
Limite de detecção: 600 UI/mç ou 1620 cópias/ml
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Teste quantitativo carga viral:
É utilizando um padrão que acompanha cada amostra durante o PCR;
O teste foi validado para plasma humano coletado em EDTA;
Deve-se evitar a eparina.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Genotipagem:
Visa identificar os subtipos de HCV;
Usado para definir o melhor tratamento;
É necessário uma carga viral superior a 600 UI/ml;
Não fornece nenhum prognostico sobre a progressão da doença;
5’ UTR e core;
Envelope E1 e NS5B.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Genotipagem não comercial:
RT – PCR;
PCR “primer”;
Outros métodos de genotipagem na região 5’UTR.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Genotipagem não comercial:
PCR Real Time:
Real-time PCR
Monitora a fluorescência emitida
durante a reação como um indicador da produção
de amplificado em cada ciclo de PCR.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Genotipagem não comercial:
PCR Real Time:
Vantagens:
Não influenciado por amplificação não específica;
A amplificação pode ser monitorada em tempo real;
Não ocorre processamento pós-pcr(baixo risco de contaminação);
Ciclagem ultrarrápida (30 minutos a 2 horas);
Mais específico, sensível e reprodutivo.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Genotipagem não comercial:
PCR RFLP:
Baseia-se em duas reações de digestão enzimática;
RM1: utiliza-se as enzimas de restrição HaeIII e RsaI;
RM2: as enzimas utilizadas são MvaI e HinfI.
T1 (ambas as reações): 37 º C, 12 horas;
T2: aquecimento a 70 º C por 10 minutos;
Após as reações o material deve ser armazenado a – 20 ºC até a analise em gel de eletroforese.
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
V. Diagnóstico de Biologia Molecular
Genotipagem comercial:
Hibridização reversa;
Sequenciamento da região 5’UTR;
Invader HCV ASR;
Abbot HCV ASR;
TRUGENE NS5B sequencing assay;
Ensaios de sorotipagem.
VI. Tratamento
Utilização de Interferon;
Transplante de fígado.