Relatório Extração de DNA e Eletroforese

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UNIVERSIDADE POSITIVO 
CAMILA PENKAL 
CAMILA MENDES 
DANIELE DE A. MIKOVSKI 
JHULLY ANNI SURDI 
NATÁLIA LAUREDO 
PAULO ALEXANDRE S. DA SILVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Extração de DNA e Eletroforese de DNA genômico 
 
 
CURITIBA 
2016 
CAMILA PENKAL 
CAMILA MENDES 
DANIELE DE A. MIKOVSKI 
JHULLY ANNI SURDI 
NATÁLIA LAUREDO 
PAULO ALEXANDRE S. DA SILVA 
Extração de DNA e Eletroforese de DNA genômico 
Relatório apresentado à disciplina de 
Biologia Molecular, do curso de 
graduação de Engenharia de 
Bioprocessos e Biotecnologia; Professor 
Diogo Robl. 
CURITIBA 
2016
1. OBJETIVOS 
As aulas práticas tinham como objetivos principais extrair DNA de levedura 
e, posteriormente, realizar a eletroforese para analisar a presença e integridade do 
material genômico extraído, separando os fragmentos do ácido nucleico que 
possuem tamanhos diferentes. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
2.1. Extração 
2.1.1. Materiais 
Tampão TE (0,01M Tris-HCl, pH 8,0; 0,01M EDTA); 
Tampão TEN (0,01M Tris-HCl, pH 8,0; 0,01M NaCl; 0,01M 
EDTA); 
SDS 10%; 
Proteinase K 20mg/mL; 
Clorofórmio; 
Solução fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1); 
Solução clorofórmio: álcool isoamílico (24:1); 
Acetato de sódio 3M; 
Etanol absoluto; 
Etanol 70°; 
Cultura de levedura; 
Tubos de Falcon; 
Centrífuga; 
Vórtex; 
Microtubos; 
Banho-maria; 
Pérolas de vidro; 
Freezer. 
 
2.1.2. Métodos 
 Os métodos foram dispostos em um fluxograma indicando todas as etapas do 
protocolo de extração de DNA. 
 
 
 
 
Adição 500 µL Solução de 
Clorofórmio - Homogeneização 
COLETA INICIAL: 
Saccharomyces cerevisiae 
 
10 mL de Cultura de levedura 24 H 
em tubo Falcon 
PRIMEIRA CENTRIFUGAÇÃO 10000 xg por 15 minutos, em 
4°C 
 
 
10000 xg por 15 minutos. 
1000 
Descarte do 
sobrenadante 
Precipitado + 500 µL Tampão TE 
- Vórtex 
SEGUNDA CENTRIFUGAÇÃO 
Descarte do 
sobrenadante 
Precipitado + 500 µL Tampão TEN 
– 2 mL no Microtubo 
 
RESSUSPENSÃO 
 
BANHO MARIA 50° C Por 30 minutos 
 
10 µL SDS 10% +10 µL de 
Proteinase K 
Vórtex 
TRANSFERÊNCIA DE VOLUME 
Adição de Pérolas de Vidro- 
Vórtex - 10 minutos 
Sobrenadante + 500 µL Solução de 
Fenol Clorofórmio (Álcool 
Isoamílico) 
 
TERCEIRA CENTRIFUGAÇÃO 13000 xg por 10 minutos 
 
 
10000 xg por 15 
minutos. 
1000 
Transferir a 
Fase 
Aquosa 
superior 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Freezer a -20°C - Overnight 
QUARTA CENTRIFUGAÇÃO 13000 xg por 10 
minutos 
 
 
10000 xg por 15 
minutos. 
1000 
QUINTA CENTRIFUGAÇÃO 
Descarte do 
sobrenadante 
INCUBAÇÃO 
 
SÉTIMA CENTRIFUGAÇÃO 
500 µL de Solução 
Clorofórmio Pura 
Vórtex 
ESTUFA 
 37°C 
Precipitado + 300µL de 
Etanol 70°C 
Sobrenadante + 500 µL de Fenol 
Clorofórmio (Álcool Isoamílico) 
 
SEXTA CENTRIFUGAÇÃO 
13000 xg por 10 minutos 
 
 
10000 xg por 15 
minutos. 
1000 
Transferir a 
Fase 
Aquosa 
superior 
13000 xg por 10 
minutos 
 
 
10000 xg por 15 
minutos. 
1000 
Transferir a 
Fase 
Aquosa 
superior 
 10% de Acetato de Sódio 3M 
+ 2 volumes de Etanol 
Absoluto 
Descarte do 
sobrenadante 
Ressuspensão + 100µL 
Água Ultrapura 
ESTOCAGEM DA AMOSTRA 
 -20°C 
ROMPIMENTO CELULAR 
 O rompimento celular consiste ser a primeira etapa na separação dos 
componentes intracelulares, é considerada a etapa mais importante do processo de 
extração, pois se houver um rompimento incorreto da célula, pode ocasionar danos 
que possa interferir todas as fases a seguir. Para realizar o rompimento celular da 
Saccharomyces, utilizou-se o método de rompimento mecânico por cisalhamento 
com pérolas de vidro, que é considerado um método eficaz e ideal para o uso em 
laboratórios, este método consiste em utilizar perolas de vidro, adicionando-as em 
tubos corretos que já contém um volume da suspensão do DNA, em seguida realiza 
a agitação, para que haja o rompimento celular, logo após vem à etapa da filtração 
para reter as pérolas e deixar apenas o produto desejado. 
 
NaCl 
 Na extração do DNA é importante o uso de um sal, para proporcionar ao DNA um 
ambiente favorável, o NaCl contribui com íons positivos e íons negativos, sendo o 
caso, que os positivos possuem a função de neutralizar a carga negativa do DNA, e 
as cargas negativas tem como função neutralizar as histonas, permitindo o 
acoplamento de DNA + Histonas, além da função de neutralizar as cargas, o NaCl 
também participa na dissociação das proteínas associadas aos ácidos nucleicos, e 
também o sal aumenta a densidade do meio, facilitando a migração do DNA para o 
álcool. 
 
SDS 
 É conhecido como um detergente sódio dodecil sulfato, determinado como 
agente que solubilizada lipídeos, no entanto tem como principal função desnaturar 
as proteínas da membrana, separando-as do DNA cromossômico, também participa 
no rompimento das ligações não-covalentes, além de realizar o rompimento e a 
desnaturação o SDS certifica que não há nenhuma nucleasse que não depende de 
Mg2, cause qualquer tipo de degradação. 
 
PROTEINASE K 
 A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium álbum, é capaz de 
digerir a queratina (Keratin), daí o nome “Proteinase K”. Essa enzima é de 
fundamental importância para extrair ácidos nucleicos de boa qualidade para que o 
mesmo possa ser amplificado pela técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) 
para posteriores análises. Tal enzima tem a ação de clivar as proteínas nas ligações 
peptídicas que possuam o grupo carboxila de lisina ou de arginina, tendo sua 
atividade aumentada em temperaturas elevadas, elas rapidamente inativam as 
nucleases, que degradam o DNA e RNA. A proteinase K não apresenta 
especificidade significativa para clivar proteínas hidrofóbicas (DNA e RNA) 
encontrando aplicação na preparação de protocolos de extração. 
 
PÉROLAS DE VIDRO 
 Devido ao tamanho maior e à diferença na estrutura da parede celular, a ruptura 
de leveduras em geral é mais fácil que a ruptura de bactérias. Os componentes 
básicos da parede celular de leveduras são glucanas, mananas e proteínas. Em 
geral, métodos mecânicos não são específicos, mas possuem alta eficiência e ampla 
aplicação em comparação com outros métodos. O uso de pérolas de vidro é 
bastante comum em laboratório, são utilizadas basicamente pérolas de vidro de 0,5 
mm de diâmetro, essas são adicionadas a um tubo contendo uma quantidade 
pequena de suspensão celular e são agitadas vigorosamente, para que possa ser 
feito o rompimento celular. 
 
TAMPÃO TE 
Tampão TE (0,01M Tris-HCl, pH 8,0; 0,01M EDTA), possui como aplicação no 
inicio da extração do DNA, diminuir a hidrolise das bases através da quelação de 
íons divalentes, que tem como função inibir a ação das RNAses e DNAses, aplica-se 
também na ressuspensão de precipitados de DNA, proporcionando um pH 
adequado para manutenção dos ácidos nucleicos. 
 
SOLUÇÃO FENOL CLOROFÓRMIO 
 O fenol tem como função provocar desnaturação nas proteínas, o clorofórmio 
possui também a mesma função, isto é, podem ser classificados como agentes 
desnaturantes, a mistura entre fenol e clorofórmio é muito eficaz para desproteinizar, 
onde fundamentam-se no domínio hidrofóbica das proteínas, onde após o processo 
de desnaturação ocorre a formação de uma camada na interface entre as duas 
fases, separando o DNA. A solução clorofórmio promove a extração delipídeos, 
proteínas, que estão dissolvidas no interior do solvente orgânico, enquanto o DNA 
permanece na fase aquosa, a separação ocorre por meio de uma centrifugação. 
A precipitação do DNA ocorre através da utilização do etanol, que induz a 
transição estrutural nas moléculas, também participa na remoção de resíduos de 
fenol e clorofórmio, assim como o acetato de sódio é altamente eficaz na 
precipitação do DNA, este auxilia na separação do DNA plasmidial do DNA 
cromossômico e é mais solúvel em etanol. 
 
ÁGUA ULTRAPURA 
 A água ultrapura é produzida por meio de uma osmose reversa, e ultra 
filtração, possui características importantes e tem como função primordial na 
preparação de soluções que exijam qualidade analítica, e com alta pureza, com 
função de ressuspender o DNA. 
 
2.2. Eletroforese 
 
2.2.1. Materiais 
TBE 1X; 
Agarose; 
Tampão de amostra; 
Ladder 1kb; 
Brometo de etídeo 10%; 
Erlenmeyer; 
Microndas; 
Cuba de corrida para eletroforese; 
Transluminador. 
 
2.2.2. Métodos 
 Os métodos foram dispostos em um fluxograma indicando todas as etapas do 
protocolo de eletroforese. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CUBA DE CORRIDA 
 
CUBA COM VOLTAGEM 
120V 
TRANSFERÊNCIA DE CUBA 1 
0,5g Agarose + 60mL Tampão de 
Corrida TBE 1X 
Adição Tampão TBE 
1X 
 
 
10000 xg por 15 
minutos. 
1000 
Aplicação 3µL Marcador de tamanho 
pares de bases 
 
Microndas – Intervalos de 
30-15 segundos 
 
Solução contendo: 20% Ficoll 400 
+ 0,1 EDTA pH 8,0 + 0,1% SDS + 
0,25% Azul de Bromofenol 
Cuba contendo Brometo de 
Etídeo 10% por 15 minutos 
PREPARAÇÃO DO GEL DE 
AGAROSE 0,8% 
 
GEL DE AGAROSE SOBRE O 
BERÇO 
 
Solidificação – Cerca 
de 15 minutos 
 
APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS 
NO GEL DE AGAROSE 
 
PREPARAÇÃO DOS POÇOS 
 
7 µL Dna genômico 
extraído + 3 µL 
Tampão 
 
Corrida das 
Amostras no Gel 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 A agarose ou ágar é um polissacarídeo que forma uma rede prendendo as 
moléculas durante a migração, por isso é utilizada como matriz na eletroforese em 
gel, separando as moléculas do ácido nucleico através dos seus pesos moleculares. 
Há uma diferença no gradiente de separação conforme a concentração usada de 
agarose no preparo do gel. 
 
Tampão TBE 1X 
 O TBE ou Tris/Borato/EDTA é uma solução tampão frequentemente usada em 
procedimentos envolvendo ácidos nucleicos. Em sua composição encontramos as 
soluções Tris-ácidas (no caso o ácido bórico) e EDTA. A principal função da solução 
Tris-borato é atuar como tampão para condições levemente básicas, que mantém o 
ácido nucleico livre de prótons e solúvel em água. Já o EDTA atua como agente 
quelante de metais (cátions divalentes, como Mg2+) que, porventura, possam ativar 
algumas nucleases que dependam desses cátions como cofatores, protegendo, 
portanto, o DNA de uma possível degradação enzimática. Além disso, é importante 
para manter o pH da solução. 
 O gel de agarose preparado por agarose e tampão de corrida TBE é aquecido no 
microndas para a completa solubilização do ágar, isso é garantido quando a solução 
se torna límpida e sem nenhum resquício de ágar sólido. A solução não deve ferver, 
ANÁLISE DO GEL 
 
TRANSLUMINADOR 
Lavagem do gel 
TRANSFERÊNCIA DE CUBA 2 
Cuba contendo Água Ultrapura 
Comprimento de Onda 470nm 
por isso é necessária uma atenção redobrada nesta etapa. Após o esfriamento, o gel 
pode ser vertido sobre o berço já com o pente posicionado. A etapa de espera da 
solidificação do gel também requer cuidado, pois se o pente for retirado com o gel 
não totalmente sólido, os poços não são formados e perdemos a matriz. O gel se 
torna fosco conforme for solidificando, isso facilita a observação. 
 
TAMPÃO DE AMOSTRA 
 O tampão de amostra utilizado na mistura com o DNA genômico contém corantes 
e reagentes de alta densidade (Ficoll), a composição utilizada foi 20% (m/v) de Ficoll 
400; 0,1M de EDTA pH 8,0; 0,1% (m/v) de SDS e 0,25% (m/v) de azul de 
bromofenol. O Ficoll assegura que a amostra de DNA entre no poço pela força de 
gravidade. O SDS é uma molécula anfifílica usada como desnaturante, ou seja, com 
o objetivo de proporcionar uma carga líquida negativa para o ácido nucleico, fazendo 
com que o DNA fique agregado ao redor desta molécula. O corante azul de 
bromofenol facilita a aplicação da amostra no gel, auxiliando no monitoramento da 
corrida, pois apresentam velocidade conhecida durante a migração na matriz. O azul 
de bromofenol migra juntamente com um fragmento de DNA com aproximadamente 
0,3kb. 
 
MARCADOR DE TAMANHO DE PARES DE BASES 
 A fim de permitir uma comparação do tamanho dos fragmentos de DNA 
presentes na amostra analisada é necessária a aplicação de um marcador de peso 
molecular, conhecido como ladder. O ladder funciona como uma amostra positiva, 
contendo diversos fragmentos de DNA com tamanhos conhecidos. 
Brometo de etídeo 
 Para a visualização do DNA em gel de agarose é utilizado o brometo de etídeo 
na etapa de coloração. O corante se posiciona entre as bases dos ácidos nucleicos 
e, em exposição à luz ultravioleta (comprimento de onda utilizado 470nm), fluoresce 
em vermelho alaranjado. A intensidade da fluorescência é proporcional à 
concentração de DNA presente na amostra. A água ultrapura é utilizada para a 
lavagem do gel antes da sua exposição no transluminador. 
 
 
 
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 
 A eletroforese é uma técnica de separação de partículas de acordo com 
sua carga elétrica e peso molecular. Permite a separação de RNA, DNA, proteínas e 
enzimas. O gel forma poros que prendem as moléculas durante a migração, 
moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade de migrar pelo gel do que 
as de maior peso molecular, e percorrerão distâncias maiores ficando mais próximas 
do polo positivo. 
 Nos dois primeiros poços da eletroforese, foram adicionados os ladders, sendo 
marcadores de peso molecular, utilizados para comparação da distância que a 
amostra que percorreu no gel a partir do ponto de sua aplicação. Nos poços 
seguintes, foram adicionados uma mistura de 7µL de DNA genômico e 3 µL de 
tampão de amostra, onde cada equipe aplicou devidamente suas amostras nos 
poços delimitados e escolhidos, seguidos depois do poço ladder, aplicando a 
voltagem no gel de agarose e depois seguindo os passos de visualização. 
 
 
Figura 1: Gel da eletroforese. 
 
 
Figura 2: Poços dos grupos identificados. 
 
 Na figura 1 acima pode-se observar o gel já pronto, visto através 
do transluminador, em comprimento de onda 470nm, que garante melhor 
visualização das amostras utilizando a luz UV sobre o gel corado com brometo de 
etídeo a 10%. 
 A intensidade de fluorescência emitida está diretamente proporcional à massa 
molecular do fragmento de ácido nucleico. Portanto as amostras do grupo (grupo 3), 
comparadas com as demais, apresentam baixa concentração de DNA na amostra, 
entretanto, está mais limpo visualmente com concentração de proteínas, tendo maior 
garantia que o processo de extração e aplicação da amostra foram corretos. Já o 
RNA presente, pode-se observar que nas amostras aplicadas, comparada com as 
demais equipes, não apresenta manchas de arraste de proteínas durante a corrida 
das amostras no gel, comparando com o RNA no início dos poços. Isso indica que 
não houve degradação do DNA presente e que não houve erros no processamento 
tanto das etapas do processo depreparo quanto nas soluções aplicadas que 
garantiam que não tivesse nenhuma nucleasse ou algo presente que danificasse o 
resultado esperado das amostras. 
As amostras do grupo 2 foram as que emitiram maior intensidade na 
fluorescência, entretanto, também apresentam maior mancha de arraste, indicando a 
presença de proteínas e RNA. A presença de rastro abaixo das bandas indica 
degradação, um bom DNA deve exibir bandas bem definidas e sem rastros. 
 
Comparação de Protocolos 
Os procedimentos de extração de DNA genômico de Saccharomyces 
cerevisiae utilizado no experimento, possui algumas diferenças em relação ao 
descrito por Hoffman CS e Winston F.,1987. Onde utilizaram um tampão de lise 
específico, contendo os componentes do tampão TEN, 1% de SDS a 20% e 2% de 
Triton-X100 à 10% (usado como um segundo detergente complementando o SDS), 
pérolas de vidro preparadas (mergulhadas no ácido nítrico durante 1hora, lavadas 
com água pura e assadas) para aumentar a força de cisalhamento, Acetato de 
amônio (NH4O-ac) utilizado como salting-out para precipitar proteínas ou precipitar 
ácidos nucleicos e RNAses para degradar os fragmentos de RNA presentes na 
amostra, que por sua vez não foi utilizada, pois a visualização do arraste de RNA no 
gel de eletroforese era um objetivo proposto no experimento. 
O protocolo de procedimentos para a realização de eletroforese utilizado no 
experimento possui duas divergências, quando comparado com um protocolo base, 
sendo uma enquanto a escolha do tampão de corrida e a outra enquanto o 
procedimento de coloração do gel. O protocolo base utiliza tampão TAE 
(Tris/Acetato/EDTA), mesmo que o TBE (Tris/Borato/EDTA) aumente a velocidade 
de corrida no gel e possua algumas vantagens, o Borato é um grande inibidor 
enzimático e impede ligações covalentes, inutilizando o DNA para um possível 
processo futuro de clonagem. No protocolo base há incorporação de Brometo de 
Etídeo durante a preparação do gel de agarose, pulando a etapa futura de 
coloração. Porém, o brometo de etídeo é um agente com grande potencial 
mutagênico e intercalante de DNA que se posiciona entre as bases dos ácidos 
nucleicos, fazendo com que haja um desvio na corrida do gel pelo aumento do peso 
molecular da amostra. 
 
4. CONCLUSÃO 
Pudemos observar através do protocolo seguido em aula prática que algumas 
mudanças foram feitas com relação a protocolos base, essas mudanças tiveram 
como objetivo melhorar a eficiência do gel trabalhado no processo de eletroforese. 
Após as várias técnicas utilizando tampões, detergentes, sais, entre outros, 
para se fazer uma extração apropriada, foi possível analisar a qualidade e 
quantidade do material genético através da técnica da eletroforese. Com a foto do 
gel observamos que os poços da equipe apresentaram uma quantidade menor de 
DNA comparado aos outros grupos, entretanto o material estava mais limpo de 
proteínas e RNA e sem conter rastros, o que possivelmente determinaria sua 
escolha para uma amplificação através da técnica de PCR, conseguindo um bom 
resultado para sua multiplicação e tecnologia de DNA recombinante. 
 
5. REFERÊNCIAS 
SILVA; LARA ENDRES DA – Variação de concentração de proteinase k em 
protocolos de extração de DNA bovino. Archives of Veterinary Science v.18, n.2, 
p.15-19, 2013. 
MEDEIROS; FABIANA OLIVEIRA, ALVES; FERNANDA GERMANO, LISBOA; 
CRISTIANE REINALDO, MARTINS; DANIELA DE, BURKERT; CARLOS ANDRÉ 
VEIGA E KALIL, SUSANA JULIANO – Ondas ultrassônicas e perola de vidro: um 
novo método de extração de b-galactose para uso em laboratório. Quim. Nova, 
Vol. 31, No. 2, 336-339, 2008. 
NEVES, L. C. M, Anexo: Estudo dos métodos mecânicos de rompimento celular. 
Hoffman C.S. and Winston F., 1987. A ten-minute DNA preparation from yeast 
efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia 
coli. Gene 57, 267-272 
Acessado em 31/05/2016 às 10:38 
<http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/p_do06_2.htm>; 
Acessado em 31/05/2016 às 10:39 
<http://www.ciencianews.com.br/arquivos/ACET/IMAGENS/biologia_molecular/testes
geneticos.pdf>; 
Acessado em 31/05/2016 às 10:11 <http://www.i2bio.org/wp-
content/uploads/BIOLOGIA-MOLECULAR-APLICADA-%C3%80-MEDICINA-
FUNDAMENTOS-TE%C3%93RICOS-E-METODOL%C3%93GICIOAS.pdf>; 
Acessado em 31/05/2016 às 10:12 <http://www.labome.com.br/method/DNA-
Extraction-and-Purification.html>; 
Acessado em 01/06/2016 às 10:11<https://pt.scribd.com/doc/30280669/Relatorio-de-
Extracao-de-DNA>; 
Acessado em 01/06/2016 às 10:25 
<http://www.seara.ufc.br/sugestoes/biologia/biologia003.htm>; 
Acessado em 01/06/2016 às 10:20 
<http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf>; 
Acessado em 01/06/2016 às 10:30 
<http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-
molecular-tecnicas-moleculares/>.