Relatório PCR

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UNIVERSIDADE POSITIVO
CAMILA PENKAL
DANIELE MIKOVSKI
JHULLY ANNI SURDI
Reação em Cadeira da Polimerase (PCR)
CURITIBA
2016
UNIVERSIDADE POSITIVO
CAMILA PENKAL
DANIELE MIKOVSKI
JHULLY ANNI SURDI
Reação em Cadeira da Polimerase (PCR)
 Relatório apresentado à disciplina de
 Biologia Molecular, do curso de graduação
de Engª de Bioprocessos e Biotecnologia;
Professor Me. Matheus Severo.
CURITIBA
2016
Objetivos
 Amplificar a quantidade da amostra de DNA extraído em aulas anteriores (plasmídeo) utilizando a enzima Taq polimerase, primers com Tm similares e variações de temperatura controladas.
Introdução
 	 O método de PCR (reação em cadeia da polimerase), permite que um fragmento especifico da molécula do DNA seja amplificada, isto é, consiste na (criação de múltiplas cópias), em algumas horas, a partir de uma amostra de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo. Por meio da PCR, é possível obter diversas copias do material genético, para possível detecção e uma analise da sequencia alvo. A PCR é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de "impressão digital" genética (usado em testes de paternidade e na medicina forense), detecção de diagnóstico de doenças infecciosas e criação de organismos transgênicos.
	Para realizar a PCR, seguimos alguns passos, tais como, primeiramente extraímos o DNA da amostra que deseja analisar, após a extração realiza-se a purificação da DNA, em seguida prepare-se a mistura conhecida como Mix, leva-o ate o termociclador, portanto, o processo inicial ocorre a preparação de uma mistura com a amostra de DNA (que, nesse caso, era plasmidial), utiliza-se a enzima que é responsável pela síntese, Taq polimerase, que é extraída da bactéria Thermus Aquaticus, que é denominada como uma enzima estável, os nucleotídeos de DNA, além da enzima utiliza-se o tampão e os primers (sintetizam a sequencia alvo no sentido 3’-5’), portanto o primer é uma sequencia de nucleotídeos que hibridizam o inicio da sequencia alvo que deseja amplificar (ou seja, as novas sequências de DNA que serão implementadas) e, após isso, a mistura é distribuída em tubos eppendorf. Após reconhecer o primer a polimerase realiza a síntese de uma copia complementar. Os tubos são colocados em um termociclador (equipamento que aumenta e diminui a temperatura controladamente de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro do termociclador controlados pelo programa. Aquece-se o tubo a aproximadamente 95ºC para desnaturar o DNA (separar a dupla fita), etapa denominada de desnaturação. A enzima Taq polimerase não é desnaturada nessa etapa, pois é termoestável e esse é o principal fator que a torna adequada para a PCR. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a aproximadamente 55ºC, fase chamada de anelamento, pois os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase), fase de extensão, para a síntese das fitas no sentido 5’ → 3’. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, colocando os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementariedade, formando assim duas novas fitas dupla.
Após a Etapa da extração, purificação do DNA, preparação do Mix e a incubação iniciamos a eletroforese (gel agarose, utilizado para separação de partículas pequenas), onde descreve a migração das partículas carregadas, por meio de um campo elétrico, que quando a diferença potencial for aplicada as moléculas iram se separar devido as diferentes mobilidades, após o campo elétrico, ser removido, as moléculas separadas são localizadas no gel através da coloração ou por autorradiografia. O DNA contem carga negativa, portanto migra para polo positivo, se o gel estiver muito concentrado, haverá dificuldades para a partículas atravessa-lo, a velocidade da migração, vai interferir ao campo elétrico que amostra esta submetida, e ao seu tamanho.
Materiais e Métodos
Materiais
- Tubo eppendorf 1,5ml;
- Tubos 200μL;
- Água deionizada;
- Tampão 10mM Tris-HCl, pH 8,0, 50mM KCl;
- Solução de dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
- Oligonucleotídeos iniciadores (primers forward e reverse);
- Taq polimerase;
- Pipetador;
- Ponteiras;
- Termociclador.
Métodos
- Preparou-se o mix da reação em um tubo eppendorf 1,5mL, de acordo com o quadro a seguir:
	
	Concentração inicial
	Concentração final
	Volume para 1 reação (μL)
	Volume para 5 reações – 5x (μL)
	H2O
	-
	-
	12,4
	62
	dNTP 10mM
	10mM
	1mM
	0,4
	2
	Buffer
	10X
	1X
	2,0
	10
	MgCl2
	25mM
	2,5mM
	2,0
	10
	Primer ITS1
	10μM
	0,5μM
	1
	5
	Primer ITS4
	10μM
	0,5μM
	1
	5
	Taq polimerase
	5 U/μL
	1 U/μL
	0,2
	1
	Total
	
	
	19
	95
- Identificou-se os tubos 200μL da reação: (1) Controle positivo, (2) Controle negativo, (3) Amostra, (4) H2O;
- Distribuiu-se 19μL (volume de 1 reação) para cada tubo;
- Diluiu-se (diluição seriada) o DNA para 1:10, 1:25, 1:50 e 1:100 da seguinte forma:
 1:10 → 1:25 → 1:50 → 1:100
	1μL DNA
	5μL A
	5μL A
	5μL A 
	9μL H2O
	7,5μL H2O
	5μL H2O
	5μL H2O
	= 10 μL
	12,5 μL
	10 μL
	10 μL
- Colocou-se 1μL da amostra de DNA em cada tubo com o mix da reação;
- Colocou-se os tubos no termociclador para a execução de 35 ciclos de PCR seguindo o esquema a seguir:
95°C por 2min;
95°C por 30s;
55°C por 1min;
72°C por 1 min;
Volta para o passo II, repetindo-se o ciclo 35 vezes;
72ºC por 2min;
10°C até que os tubos sejam retirados do termociclador. 
REFERENCIAS:
Disponível<http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/pcr2.htm> Acessado no dia 26/09/2016;
Disponível< http://www2.iq.usp.br/docente/miyamoto/DEG_5_Tecnicas_eletroforeticas.pdf> Acessado no dia 26/09/2016.