Bioquímica Propriedades das proteínas

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Propriedades das Proteínas
Disciplina: Bioquímica
Docente: Ivanilton Almeida Nery
Discentes: João Vitor Assunção, Jonatas Costa, Matheus Menezes, Renan Rezende, Victor Hugo P. Gomes, Vitor Yu Zhu.
Turma: QIM261
Data de realização da aula prática: 07 de fevereiro de 2014
Data de entrega do relatório: 21 de fevereiro de 2015
Introdução Teórica
Proteínas são polímeros não ramificados de aminoácidos e estão presentes em todos os seres vivos. Elas fazem parte na maioria dos processos celulares que ocorrem na célula, sendo muitas delas enzimas, pois catalisam reações bioquímicas. 
A solubilidade de proteínas está relacionada à distribuição das cargas elétricas na molécula. Quanto mais carregada, positiva ou negativamente, uma proteína está mais solúvel ela é, pois se a proteína possui excesso de carga positiva ou negativa, ocorre repulsão entre as moléculas e assim, aumentando a interação delas com o solvente. Quando a proteína encontra-se com um equilíbrio de cargas, chama-se esse equilíbrio de ponto isoelétrico, onde a proteína esta em sua forma chamada zwitteriônica. Uma das formas de promover a precipitação da proteína é atingir seu ponto isoelétrico, pois quando há um equilíbrio de cargas na molécula, tende a ocorrer uma disputa de interações da molécula com solvente e moléculas de proteína com moléculas de proteína, diminuindo então sua solubilidade no solvente. Cada proteína possui um ponto isoelétrico distinto, logo, é possível identificar e distinguir proteínas com essa propriedade, porém, para que seja efetivado com precisão, é necessário saber os pontos isoelétricos das proteínas em questão e que seus pontos sejam distantes um do outro. No caso da caseína esta em torno de pH 4,6, ou seja, em um meio em que o pH esta próximo a este valor, há a presença e predominância da forma zwitteriônica da proteína.
Uma forma comum de manipular a solubilidade de proteínas é através do Salting in e Salting out. Salting in refere-se ao efeito onde ao se aumentar a força iônica de uma solução, aumenta-se a solubilidade de um soluto como uma proteína, pois os íons provenientes de um sal neutro tendem a diminuir as interações proteína-proteína e a aumentar as interações proteína-solvente. O salting out é o efeito que devido ao excesso de sal neutro na solução, o solvente acaba por solubilizar as partículas menores provenientes do sal em excesso (que varia de proteína para proteína) ao invés de solubilizar a proteína.
Outra forma de precipitação de proteínas é pela ação do calor, pois como proteínas possuem uma estrutura definida que é relativamente sensível à ação da temperatura, o calor é capaz de causar desorganização nas cadeias peptídicas, sendo esse processo chamado desnaturação.
Uma terceira forma de alterar a solubilidade de uma proteína é pela adição de solventes orgânicos, pois a capacidade de interação com as partículas da proteína é diferente para cada solvente. A precipitação por solventes orgânicos está diretamente relacionada a temperatura, pois a temperaturas baixas, os solventes orgânicos são úteis na separação de misturas de proteínas, porém em temperaturas altas, os solventes podem causar a desnaturação da proteína através do rompimento das ligações de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares.
As proteínas podem ser identificadas a partir do teste com o reagente de Biureto, reagente que se complexa com moléculas de proteínas do meio formando uma coloração roxa. Esse complexo formado, ocorre por decorrência a ligação das aminas presentes nas moléculas de proteína aos íons cúprico presente no reagente de Biureto. Por esse método, é possível apenas verificar a presença ou não de proteínas, sendo imprópria para a distinção de duas ou mais proteínas distintas.
Objetivos
Observar o comportamento de cada tipo de proteína quando em frente a mecanismos de solubilidade, desnaturação e identificação. Dessa forma estudando as propriedades das proteínas.
1 - Aparelhagem e Material utilizado:
2 Bastões de vidro;
2 Béqueres de 250 mL;
Pipetas graduadas de 2 e 5 mL;
Peneiras de plástico;
Tubos de ensaio.
1 Bastão de vidro;
2 Béqueres de 250 mL;
3 Pipetas graduadas de 5 mL;
1 Pipeta graduada de 2 mL;
1 Peneira de plástico;
5 Tubos de ensaio de vidro;
1 Tubo plástico para centrifugação.
2 - Reagentes:
Clara de ovo;
Leite desnatado;
Água destilada;
Solução de Cloreto de sódio 1M;
Solução de Sulfato de amônio (NH4)2SO4 70% (p/v);
Solução de Ácido clorídrico (HCl) 2%; 
Etanol 95%.
Procedimentos 
1)Salting in e salting out usando clara de ovo, desnaturação por solvente orgânico e por calor:
Abriu-se um ovo separando a gema da clara e descartou a gema em um Becker. (previamente feito pelo aluno monitor).
 Para realizar a solubilização (salting in) diluiu-se 2 mls de clara de ovo em 4 mls de água destilada, logo após adicionou-se cloreto de sódio gota a gota até que a solubilização ocorresse, sempre agitando o tubo. Feito isso se realizou a precipitação sem desnaturação da proteína (saltin out) adicionando sulfato de amônia ao tubo, gota a gota, ate que precipitasse. A fim de observar a desnaturação por solventes orgânicos adicionou-se 0,5 ml de etanol 95% em 1 ml de clara de ovo. Já a desnaturação por calor, pôs-se 2 ml de clara de ovo em um tubo e em banho maria aqueceu-o por aproximadamente 10 minutos.
2)Precipitação isoelétrica da caseína:
Adicionou-se 2 ml de leite desnatado Elegê e 2 ml de água destilada a um tubo de ensaio. Utilizando Acido Clorídrico 2% e com o auxilio de um conta-gotas e fitas de ph, moveu-se o ph do meio até o ponto isoelétrico da caseína. Observou-se a formação de precipitado e logo centrifugou o tubo durante 10 minutos para que o precipitado fosse sedimentado. Separou-se o precipitado do sobrenadante e suspendeu-se o precipitado novamente.
3)Identificação química das proteínas( reagente de biureto):
Preparou-se 3 tubos de ensaio diferente: um com 2 ml de agua destilada, outro com 2 ml do soro do experimento anterior e o ultimo com 2 ml da suspensão do precipitado do procedimento anterior. A cada tubo adicionou-se 5 ml de reagente de biureto e esperou 10 minutos até o precipitado.
Resultados e discussões
1)Salting in e salting out usando clara de ovo, desnaturação por solvente orgânico e por calor:
Solubilização Salting in:
Quando adicionado 6mL de solução de Cloreto de Sódio, é perceptível uma maior solubilização da clara de ovo em água. Quando ao tubo havia apenas clara de ovo e água, verificava a presença de partes da clara de ovo não solubilizadas, sendo perceptível pela maior viscosidade da clara em relação a água. Os íons adicionados aumentam a força iônica do meio, pois as quantidades de carga presente são aumentadas, proveniente da dissociação do sal adicionado. Esses íons liberados passam a interagir com as moléculas de proteína, dificultando a interação entre proteínas, desta forma desfavorecendo a interação proteína – proteína, ou seja, favorecendo a interação proteína – solvente e aumentando a solubilidade delas no meio.
Assim, a adição em pequenas quantidades de sal neutro, aumentam a força iônica do meio que favorece a solubilidade das proteínas em água, desta forma, aumentando a estabilidade das proteínas. Esse efeito é chamado de salting in.
	Precipitação sem desnaturação (salting out): 
Ao adicionar 5mL de solução satura de sulfato de amônio ao tubo do experimento anterior, é verificada a precipitação da proteína, apresentando um aspecto branco. Isso ocorre, devido a alteração da força iônica do meio, que em grandes quantidades de sais neutros, a solvatação pela água, esta sendo competida pelos íons dos sais em excesso e pelas moléculas de proteína do meio. Como os íons dos sais são menores em relação a proteína, a água prefere solvatar estes, ignorando as moléculas de proteína, ocorrendo um processo de “secagem” das proteínas presentes. Deste modo, a solubilidade em água das proteínas é reduzida e consequentemente, a interação proteína-proteína é favorecida,ou seja, precipitando a ovoalbumina (principal proteína da clara do ovo). Esse efeito é chamado de Salting out.
Desnaturação (solventes orgânicos):
Ao adicionar 0,5mL de álcool etílico em 1mL de clara de ovo, percebeu-se a precipitação, formando uma turvação esbranquiçada. Cada soluto interage de forma diferente com cada solvente, assim, a proteína apresenta diferentes interações com determinados solventes, no caso com o solvente sendo água, a capacidade de interação de solvente soluto serão altas. Em álcool, essa capacidade de interação é menor, desta forma diminuindo a solubilidade neste meio. Essa capacidade de interação entre solvente e soluto é chamada de constante dielétrica e no caso da água, ela é alta sendo superior a do álcool.
Então, a proteína da clara de ovo em um solvente orgânico, não é solvatada por completo e precipita devido as interações proteína e proteína serem mais favoráveis do que as interações proteína e solvente. 
Desnaturação (calor):
Ao levar a banho maria o tubo contendo clara de ovo, a amostra tornou-se sólida e branca. Isto ocorreu, pois a ovo-albumina (principal proteína presente na clara do ovo) de estrutura quaternária (um arranjo específico de aminoácidos) passou para a conformação primária (sequência de aminoácidos ligados), alterando a estrutura da proteína. Como a proteína foi levada à uma alta temperatura (acima de 80°C), esta desnaturação é irreversível.
2)Precipitação isoelétrica da caseína:
Sabendo que o ponto isoelétrico da caseína é encontrado no pH = 4,6; Foi adicionado ao tubo de ensaio com 2mL de leite desnatado e 2mL de água destilada, gota a gota de HCl 2% chegando a um pH entre 4 e 5, precipitando a caseína do leite. Nesse procedimento foram adicionadas 4 gotas do ácido, o que foi suficiente para atingir o ponto onde se predomina a forma zwitteriônica da proteína.
Ponto isoelétrico (pI) é o valor de pH que um aminoácido ou uma proteína, apresenta carga elétrica líquida igual a zero. O pI se encontra no pH que há equilíbrio entre as cargas negativas e positivas dos grupamentos iônicos de um aminoácido ou de uma proteína. Em outras palavras, o pI é onde se encontram ambas as cargas positivo e negativas na mesma molécula, tendo um equilíbrio de cargas.
Desta forma, o ponto isoelétrico é onde a molécula terá menor solubilidade, pois como contém ambas as cargas, dificulta a solvatação pela água, diminuindo drasticamente a solubilidade ao ponto de forçar a precipitação de quase toda a caseína. Nesse momento, a caseína esta mais favorável a interagir com outras moléculas de caseína, diminuindo sua interação com o solvente, desta forma, diminuindo a solubilidade e precipitando.
3)Identificação química das proteínas ( reagente de biureto):
O reagente de biureto é uma solução composta por sulfato cúprico pentahidratado (CuSO4.5H2O), hidróxido de potássio (KOH) e tartarato de sódio e potássio (NaKC4O6 . 4H2O) de coloração azul que forma um complexo de coloração púrpura em presença de proteínas.
Os complexos são substâncias onde há um átomo central (metal) envolto por uma ou mais moléculas chamadas de ligantes. São muito utilizados em análises qualitativas, pois uma grande variedade deles absorve luz na região visível do espectro eletromagnético, o que confere a liberação de luz (de cor complementar à absorvida). No caso analisado, ao íon cúprico se coordenar as aminas das proteínas, há absorção de luz na faixa do alaranjado para o amarelo, configurando assim a coloração roxa que é vista a olho nu, como é mostrado na figura abaixo:
Os resultados obtidos foram os seguintes:
	Tubo de ensaio
	Resultado
	Coloração
	Tubo 1 - H2O
	Negativo
	Azul
	Tubo 2 - Soro do leite
	Positivo
	Azul arroxeada
	Tubo 3 – Suspensão do precipitado
	Positivo
	Roxa
Ao adicionar-se o reagente de biureto aos tubos 2 e 3, obtém-se o resultado positivo (formação de coloração roxa), indicando a presença de proteínas. 
As aminas secundárias presentes em proteínas possuem um par de elétrons desemparelhado, e os íons cobre (II) têm como característica orbitais “d” e “f” que permitem receber os pares de elétrons, atuando como um ácido de Lewis. O complexo formado nos tubos 2 e 3 pode ser demonstrado pela figura abaixo:
Como esperado, no tubo 1, a coloração inicial do reagente de biureto foi mantida, devido à ausência de proteínas.
No terceiro tubo, ao adicionar gotas de ácido clorídrico, ocorreu a coagulação da caseína presente do leite. A caseína é a proteína responsável pela coloração branca do leite e representa cerca de 80% das proteínas presentes no mesmo.
 No tubo que continha apenas o soro do leite, ainda havia presença de proteínas, mas em quantidade muito inferior. Tratam-se de uma mistura de proteínas globulares de ponto isoelétrico distinto da caseína. Como encontram-se em menor quantidade, o resultado obtido foi condizente com o esperado: uma coloração azul tendendo para o roxo.
Conclusão
A partir dos testes realizados durante a prática foi possível observar várias características físico-químicas das proteínas. Desde a variação de sua solubilidade com o pH, força iônica e mudança de solvente até a alteração de sua forma tridimensional quando exposta ao calor. Os testes quando feitos apresentaram os resultados que eram esperados pela teoria.
A  ovo-albúmina, proteína com a qual se trabalhou , é considerada como a proteína padrão ou de referência para comparar o valor nutritivo das proteínas de outros alimentos. Portanto é de extrema importância poder certificar-se de que todos os testes de propriedades físico-químicas podem ser aplicados corretamente a esta proteína. 
E também, é possível concluir que uma forma de identificar a caseína do leite é pelo seu ponto isoelétrico, que esta presente em pH 4,6, manipulando o pH do meio com uma solução ácida. Também possível ser detectada através do teste com biureto.
Referências Bibliográfias
“Ponto isoelétrico”, acessado em 20 de fevereiro de 2015, disponível em <http://pt.wikipedia.org/wiki/Ponto_isoel%C3%A9trico> acessado 19/02/2015.
“Precipitação de proteínas”, acessado em 20 de fevereiro de 2015, disponível em<http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/precipitacao_proteinas.htm> acessado 19/02/2015.
“Salting in”, acessado em 20 de fevereiro de 2015, disponível em <http://en.wikipedia.org/wiki/Salting_in> acessado 19/02/2015.
 “Salting out”, acessado em 20 de fevereiro de 2015, disponível em<http://en.wikipedia.org/wiki/Salting_out> acessado 19/02/2015.
VIVIAN DE ALMEIDA, vanesa, et al. Análise Qualitativa de Proteínas em Alimentos Por Meio de Reação de Complexação do Íon Cúprico, disponível em <http://http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc35_1/06-EEQ-79-11.pdf> acessado 20/02/2015.