Práticas de Microbiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECÔNCAVO DA BAHIA 
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS, AMBIENTAIS E BIOLÓGICAS 
CCA 025 – MICROBIOLOGIA GERAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
Microbiologia Geral 
 
Práticas de Laboratório 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cruz das Almas – Bahia 
 
 
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECÔNCAVO DA BAHIA 
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS, AMBIENTAIS E 
BIOLÓGICAS 
CCA 025 – MICROBIOLOGIA GERAL 
 
 
 
 
 
Microbiologia Geral 
 
Práticas de Laboratório 
 
 
 
 
 
Ana Cristina Fermino 
Carla da Silva Sousa 
Josilda Cavalcante 
Lydice Meira Haddad 
Patrícia Lopes Leal 
 
 
 
 
 
Aluno: ------------------------------------------------------------------------------- 
 
 
 
Cruz das Almas - Bahia 
3 
 
SUMÁRIO 
 
Assunto Página 
Equipamentos e vidrarias------------------------------------------------------------------------ 5 
Presença de microrganismos no ambiente-------------------------------------------------- 9 
Tipos e preparo de meios de cultura---------------------------------------------------------- 11 
Métodos químicos e físicos de controle do crescimento microbiano------------------ 14 
Isolamento de fungos, bactérias e actinomicetos do solo-------------------------------- 17 
Cultura pura: purificação e conservação de culturas-------------------------------------- 21 
Preparações e observações microscópicas a fresco, fixadas e coradas 
(coloração Gram).---------------------------------------------------------------------------------- 
24 
Isolamento de fungos de plantas com sintoma de doença------------------------------ 27 
Preparações e Observações Microscópicas de Fungos--------------------------------- 29 
Caracterização fisiológica de micro-organismos e testes de antibiose--------------- 31 
Coloração de raízes (colonização micorrízica) e extração de esporos--------------- 36 
 
 
4 
 
NORMAS PARA USO DO LABORATÓRIO DURANTE AS AULAS 
PRÁTICAS 
 
• USO OBRIGATÓRIO do jaleco durante as aulas práticas e, também, o uso de 
sapatos fechados e calças compridas; 
• No laboratório existem trabalhos de teses de alunos em andamento, desta forma É 
PROIBIDO mexer nos materiais do laboratório, concentre apenas na sua aula; 
• Na bancada de trabalho não deve haver acúmulo de objetos e materiais, bem como, 
bolsas e mochilas; 
• Após o trabalho prático deixar a bancada em ordem; 
• Cada aluno deve trazer para as aulas: isqueiro, caneta rde marcação de vidrarias 
para identificação de materiais, etc; 
• Todo material utilizado (placas de Petri, tubos, etc) deve ser devidamente 
identificado, para observações posteriores; 
• Sempre lavar as mãos APÓS o trabalho prático; 
• Em caso algum acidente, avisar imediatamente o professor. 
 
 
5 
 
EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS 
 
 
EQUIPAMENTOS 
 
 
 
 
Câmara de Fluxo Laminar 
 
 
 
Estufa de crescimento tipo 
B.O.D. 
 
 
 
 
 
 
Microscópio 
 
 
 
Estufa de secagem e esterilização Autoclave 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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VIDRARIAS 
 
 
Placa de Petri 
 
Balão volumétrico 
Proveta 
Pipeta 
Graduada 
 
Pipeta 
Volumétrica 
 
Pissete 
 
Erlenmeyer 
 
 
Tubo de Ensaio 
 
Becker 
 
 
Estante para tubos de ensaio 
 
Espátula 
 
 
 
Vidro de relógio 
 
 
 
 
 
 
 
Bastão de vidro 
 
Funil 
 
 
Pêra 
 
Alça de platina 
 
 
 
Alça de Drigalski 
 
Lamparina 
 
 
 
 
 
 
Lâmina e lamínula 
 
 
Pipeta de Paster 
 
 
7 
 
EQUIPAMENTOS 
 
Centrífuga: é utilizada para acelerar o processo de decantação devido ao movimento de rotação, que 
arremessa as partículas de maior densidade, por inércia, para o fundo do tubo. 
 
Estufa: é utilizada para esterilizações a seco (não a vapor), demora mais do que a autoclave para esterilizar. 
Esterilização de vidrarias – 2 horas a 180ºC 
Autoclave: é utilizado para esterilizações a vapor sob pressão, é o meio mais rápido de esterilização. Preparo 
de meio de cultura (30 minutos) e esterilização de material (20 minutos). 
Câmara de exaustão: é utilizada para o manuseio de reagentes e preparo de soluções, principalmente 
aqueles que liberam gases tóxicos. 
Microscópio: é utilizado para observação microscópica de materiais biológicos. 
Estufa incubadora de crescimento tipo B.O.D.: é utilizada para a incubação de microrganismos sob 
condições controladas de umidade, temperatura e luminosidade. 
Câmara de fluxo laminar: é utilizada para criar ambientes limpos permitindo o manuseio de microrganismos 
em condições assépticas. 
VIDRARIAS: 
Tubo de ensaio: é utilizado para efetuar reações químicas em análise qualitativa, com pequenas porções de 
reagentes. 
Becker: é utilizado para efetuar reações químicas com porções maiores de reagentes, recolher filtrados, fazer 
decantações, preparar soluções. Sua capacidade é variável, podendo ser graduado ou não. 
Erlenmeyer: é utilizado para efetuar reações químicas principalmente em análise volumétrica. Devido ao seu 
formato, facilita a agitação sem perda de reagente. 
Balão volumétrico: É utilizado em medições mais precisas de volumes líquidos. 
Proveta: é utilizada em medições aproximadas de volumes líquidos. Uma proveta poderá medir várias 
alíquotas (porções). 
Pipeta: é utilizada para medir volumes menores e mais acurados, se apresentam em dois tipos: 
1. Graduadas: Apresentam escala de volume, podendo medir várias alíquotas. 
2. Volumétricas: Apresentam aferição única, e medem volumes com maior precisão. 
Funil: é utilizado em filtrações simples e na transferência de líquidos de um recipiente para outro. 
Vidro de relógio: é utilizado para pesagens de reagentes (sólidos), para cobrir becker com soluções e para 
evaporar líquidos. 
Pissete: é utilizado para lavagem de precipitado, cristais, recipientes e para completar e aferir volumes. 
8 
 
Bastão de vidro: é utilizado para auxiliar na dissolução de reagentes, agitações e na transferência de um 
líquido de um recipiente para outro, evitando perdas. 
Espátula de pesagem: é utilizado na pesagem de substâncias sólidas. 
 
Funil de vidro: é utilizado para realizar operações de filtração, ou para transferir líquidos entre recipientes. 
 
Pipetadores automáticos e pêra de borracha: é utilizado para aspirar soluções através das pipetas 
graduadas e volumétricas. 
 
Alça de platina: é utilizada na repicagem de microrganismos em meio de cultura. 
 
Alça de Drigalski: é utilizada para facilitar a distribuição uniforme de microrganismos em meio de cultura. 
 
Pipeta de Paster: é um tubo de vidro de ponta bastante afilada que, enchendo-se por sucção, serve para 
transvasar líquidos. 
 
Placas de Petri: são utilizadas para o cultivo de microrganismos. 
 
 
 
9 
 
PRESENÇA DE MICRORGANISMOS NO AMBIENTE 
 
INTRODUÇÃO 
Os microrganismos são minúsculos seres vivos, individualmente muito pequenos para serem vistos a 
olho nu. O grupo inclui bactérias, fungos, protozoários e algas microscópicas. Os microrganismos são 
encontrados em qualquer ambiente, em suspensão ou assentados com a poeira em várias superfícies. Embora 
a tendência de associar os microrganismos a doenças graves, infecções desagradáveis e a inconveniências 
mais comuns, como comida estragada, esses pequenos seres vivos são em sua maioria inócuos ou benéficos, 
contribuindo de forma crucial para a manutenção do equilíbrio entre os organismos vivos e os compostos 
químicos do nosso ambiente. Nos ambientes aquáticos, os microrganismos constituem a base da cadeia 
alimentar. No solo, eles auxiliam na ciclagem dos nutrientes e na degradação de compostos poluentes. O 
homem e muitosanimais dependem dos microrganismos em seus intestinos para a digestão e síntese de 
muitos alimentos. Além disso, os microrganismos possuem aplicações comerciais participando da síntese de 
produtos químicos, tais como acetona, enzimas, drogas. A indústria de alimentos também inclui os 
microrganismos na produção de vinagre, picles, bebidas alcoólicas dentre outros produtos. O microbiologista 
deve estar apto a estimular e otimizar o desenvolvimento dos microrganismos benéficos e combater aqueles 
que causam doenças ou deterioram os alimentos e o ambiente. 
Nesta aula, o aluno deverá conhecer as normas básicas, os materiais e equipamentos necessários ao 
Laboratório de Microbiologia. Terá a oportunidade de verificar a presença de microrganismos no ambiente, 
justificando na prática a importância das normas propostas. 
 
OBJETIVOS: 
1. Reconhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratório de Microbiologia; 
2. Demonstrar a presença de microrganismos no ambiente 
 
MATERIAIS: 
Meios: Agar nutriente e BDA (batata-ágar-dextrose) 
Utensílios: placa de Petri, swabe e bico de Bunsen. 
 
PROCEDIMENTO: 
1. Exponha uma placa a uma condição de inoculação de sua preferência: 
Ar – Deixe a placa exposta ao ar, por 15 minutos ou a coloque sobre o parapeito da janela e levante a 
poeira com uma folha de papel. 
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Pele ou cabelo – Passe os dedos em vários pontos da superfície do meio de cultura na placa ou coloque 
um fio de cabelo sobre a superfície do meio de cultura. 
Respiração – Inocule a placa tossindo, assoprando ou espirrando diretamente sobre o meio de cultura. 
2. Abra uma placa na proximidade da chama do bico de Bunsen e permaneça por 1 minuto. 
3. Uma placa permanecerá fechada e será utilizada como controle para os procedimentos anteriores. 
4. As placas deverão ser identificadas com iniciais do aluno, data e turma prática. 
 
RESULTADOS: 
Enumere e caracterize (cor, tamanho e forma) as colônias que cresceram na superfície das placas 
comparando-as com a placa controle e com a placa aberta próxima ao bico de Bunsen. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ensaio Controle Bico de Bunsen 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
TIPOS E PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 
 
INTRODUÇÃO 
Os meios de cultura são associações quantitativas e qualitativas de substancias de 
contem os nutrientes necessários além das condições de oxigênio, pH, temperatura e 
pressão osmótica adequadas para o crescimento dos microrganismos. 
Os meios de cultura devem ser preparados com água destilada, aquecidos até que se 
dissolvam completamente e em seguida esterilizados por autoclavagem a 121ºC. 
 
TIPOS DE MEIO DE CULTURA 
1. Quanto ao estado físico: 
Sólidos – contém agentes solidificantes que corresponde entre 1 a 2%; 
Semi-sólidos – contém agentes solidificantes que corresponde a 0,075 a 0,5% da 
composição do meio; 
Líquidos – não contem agentes solidificantes. 
 
2. Quanto a finalidade: 
Meios de pré-enriquecimento - são aqueles que permitem a dessensibilização de 
microrganismos injuriados. 
Meios de enriquecimento – são aqueles que proporcionam nutrientes adequados ao 
crescimento de microrganismos presentes em baixos números ou de crescimento lento, 
bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. 
Diferenciais – são aqueles que contêm substâncias que permitem diferenciar 
microrganismos muito parecidos. 
Seletivos – são aqueles que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de 
determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. 
Meios de triagem – são meios que avaliam determinadas atividades metabólicas 
permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos 
microrganismos. 
12 
 
Identificação – são aqueles utilizados para a realização de provas bioquímicas e 
verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos a identificação. 
Dosagem – são aqueles empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e 
aminoácidos. 
Contagem – são aqueles empregados para a determinação quantitativa da população 
microbiana. 
Estocagem ou manutenção – são aqueles utilizados para conservação de microrganismos 
no laboratório, garantindo sua viabilidade. 
 
Função de alguns componentes do meio de cultura 
Extrato de carne – serve como fonte de carbono orgânico, nitrogênio, vitaminas e sais 
minerais. 
Peptona – serve como fonte de nitrogênio. 
Dextrose – serve como fonte de carbono 
Agar – serve para solidificação do meio, não sendo metabolizado pelos microrganismos. 
 
Meio de cultura sólido 
• O crescimento dos microrganismos é paralisado por exaustão de nutrientes; 
• É necessária a transferência das colônias para outro meio; 
• Permite a individualização de colônias; 
 
Meio de cultura liquido 
• Permite melhor difusão e obtenção de metabólitos produzidos pelos microrganismos. 
• Não permite individualização de colônias 
 
 
PREPARO DO MEIO DE CULTURA 
 
BDA (batata-dextrose-ágar) 
Batata............................100 g 
Dextrose........................10g 
Agar...............................7,5g 
 
Procedimento: 
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1. Cozinhar 100g de batata cortada em rodelas em 250 ml de água destilada; 
2. Coar e transferir os 250 ml do caldo de batata para uma proveta e completar para 500 
ml com água destilada; 
3. Transferir para becker e acrescentar os 10g de dextrose; 
4. Transferir para um erlenmeyer contendo os 7,5g do agar. 
5. Autoclavar a 121ºC por 30 minutos. 
 
Agar nutriente 
 
Peptona..........................1,25g 
Extrato de carne.............0,75g 
Ágar................................4g 
Água destilada................250ml 
 
Procedimento: 
1. Medir o volume da água destilada em uma proveta e transferir para béquer; 
2. Acrescentar os reagentes e homogeneizar com bastão de vidro até a completa 
dissolução; 
3. Transferir para um erlenmeyer contendo os 4g do agar. 
4. Autoclavar a 121ºC por 30 minutos. 
 
Observações: 
 
O erlenmeyer a ser utilizado para autoclavagem do meio deverá sempre ter a capacidade 
correspondente ao dobro da quantidade de meio a ser preparado; 
O ágar deverá ser pesado diretamente no erlenmeyer a ser utilizado para autoclavagem do 
meio, para evitar desperdício do mesmo, uma vez que este componente somente é solúvel 
a 60ºC 
 
 
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 MÉTODOS QUÍMICOS E FÍSICOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO 
 
Métodos físicos de controle do crescimento microbiano 
 
Calor seco – É a esterilização com ar quente que necessita de uma temperatura de 170ºC 
por 2 horas para oxidação das moléculas microbianas. 
 
Calor úmido – Provoca a desnaturação das proteínas, matando os patógenos bacterianos 
e fungos, e quase todos os vírus dentro de 10 minutos, embora seja menos efetivo em 
esporos. 
 
Pasteurização – É a esterilização utilizando calor (72ºC por 2 horas) para causar a 
desnaturação de proteínas de microrganismos presentes principalmente no leite e bebidas 
alcoólicas. 
 
 
Calor úmido (autoclave) 
 
Calor seco (estufa) 
 
Filtração 
 
Radiação ionizante (irradiador) Radiação não ionizante (Câmara 
fluxo laminar) 
 
Liofilização (liofilizador) 
 
 
Refrigeração – É a esterilização utilizando baixa temperatura (5ºC) para causar redução 
das reações químicas e possíveis alterações nas proteínas. Tem efeito bacteriostático, ou 
seja, não mata os microrganismos apenas inibe sua multiplicação. 
 
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Filtração – É a esterilização utilizando membranas que permitem a separação de bactérias 
de um líquido ou gás. 
Liofilização– Neste método, a água é removida por alto vácuo em baixa temperatura 
proporcionando a conservação prolongada de culturas microbianas por reduzir as reações 
químicas e possíveis alterações de proteínas. 
Radiação – Pode ser ionizante, em que a esterilização ocorre através da utilização de 
raios gama e feixe de elétrons de alta energia que destroem o DNA ou não ionizante, em 
que ocorre a lesão do DNA através da utilização de luz ultravioleta com lâmpada UV. 
 
Métodos químicos de controle do crescimento microbiano 
 
Halogênios – Atuam inibindo a função das proteínas (iodo) ou altera os componentes 
celulares (cloro). 
Fenol e compostos fenólicos - Atuam na ruptura da membrana plasmática, desnaturação 
de proteínas e desativação de enzimas. 
Álcoois – Atuam na desnaturação de proteínas e dissolução dos lipídeos. É bactericida e 
fungicida, não sendo efetivo contra esporos ou vírus não envelopados. 
Agentes de superfície – Atuam na inativação ou ruptura das enzimas (detergentes 
aniônicos) ou na inibição de enzimas,desnaturação das proteínas e ruptura das 
membranas plasmáticas. São bactericidas, bacteriostáticos, fungicidas e viricidas contra 
vírus envelopados. 
Ácidos Orgânicos – Atuam na inibição metabólica,sendo a sua ação não relacionada à 
sua acidez afetando principalmente os bolores. 
Aldeídos – Atuam na desnaturação das proteínas. 
Peroxigênios – Possuem ação oxidante, sendo muito efetivos contra os microrganismos 
anaeróbios sensíveis ao oxigênio. 
 
 
Sabonetes 
antimicrobianos 
 
Mertiolate 
 
Cloro 
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Enxaguante bucal 
 
Álcool 70% 
 
Iodo 
 
Avaliação da eficiência de antissepticos 
 
 
Material necessário: 
 
1. Placas com meio de cultura agar nutriente; 
2. Antissépticos (álcool 70%, hipoclorito de sódio 1%, enxaguante bucal PLAX, mertiolate, 
iodo e sabonete PROTEX); 
3. Algodão. 
 
Procedimento: 
1. Colocar a digital em contato com o meio agar nutriente; 
2. Escolher um antisséptico para esterilizar a digital e novamente colocar em contato 
com o meio agar nutriente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Digital 
Antisséptico 
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ISOLAMENTO DE FUNGOS, BACTÉRIAS E ACTINOMICETOS DO SOLO 
 
INTRODUÇÃO 
Isolar significa separar um tipo de microrganismo a partir de uma população que o contém. Em habitats 
naturais, raramente encontramos os microrganismos em cultura pura (um único tipo de microrganismo), 
portanto faz-se necessário um procedimento de isolamento para separar e identificar os distintos tipos de 
microrganismos presentes. 
O isolamento pode ser feito diretamente a partir de uma amostra quando os microorganismos estão numa 
proporção adequada. Quando o microrganismo que se deseja isolar se encontra em pequena quantidade, é 
realizado o procedimento chamado enriquecimento que significa elevar a quantidade do microrganismo de 
interesse com relação ao restante da população. Posteriormente se isola empregando o método de isolamento 
por estrias ou por diluição, para posterior identificação. 
 
Uma vez que o número de bactérias de uma dada amostra é muito grande, torna-se necessário diluir a 
amostra inicial e posteriormente semear um dado volume da amostra diluída em meio de Agar Nutriente, ou 
outro meio de cultura geral à escolha. 
DILUIÇÃO SERIADA 
Material necessário: 
Erlenmyer contendo 90 ml de solução salina a 0,85% 
Tubos de ensaio contendo 9 ml de solução salina a 0,85% 
Alças de Drigalski 
Pipetas automáticas de 1 ml e 50 µl 
Ponteiras das pipetas 
Placas contendo meio Agar nutriente 
Placas contendo meio Amido Caseína 
Amostras de solo rizosférico 
Vortex 
 
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Pprocedimento: 
- Pese 10 g de amostra de solo rizosferico, e transfera para Erlenmyer contendo 90 mL de solução salina NaCl 
(0,85%). Agite o Erlenmyer da amostra a analisar, de modo a misturar bem os possíveis microrganismos que aí 
se encontram. 
- 1º tubo: Retire 1ml desta amostra e transfira para o 1º tubo contendo 9 ml de solução salina. NaCl (0,85%). 
Misture bem utilizando o vortex. Este será o tubo de diluição 1: 10.Escreva no tubo a sua diluição. Pipete deste 
tubo 100µl para uma placa de Petri contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluição da amostra 
inoculada. Em seguida espalhe bem a solução com auxílio da alça de Drigalski. 
- 2º tubo: Retire 1 ml do 1º tubo e transfira para o 2º tubo de diluição, utilizando outra ponteira. Misture bem e 
identifique o tubo com a diluição correspondente 1:100. Pipete deste tubo 100µl para uma nova placa de Petri 
contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluição da amostra inoculada. Em seguida espalhe bem a 
solução com auxílio da alça de Drigalski. 
- 3º tubo: Retire 1ml do 2º tubo de diluição e transfira para o 3º tubo de diluição. Proceda da mesma forma que 
anteriormente, identificando o tubo como de diluição 1:1000. Pipete deste tubo 100µl para uma placa de Petri 
contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluição da amostra inoculada. Em seguida espalhe bem a 
solução com auxílio da alça de Drigalski. 
 
 
 
 
 
19 
 
TÉCNICAS DE SEMEADURA 
 
Podem ser utilizadas duas técnicas de sementeira distintas, de modo a atingir o objetivo de estimar o 
número de microrganismos na amostra diluída. Uma das técnicas designa-se por Sementeira por 
Espalhamento (Spread Plate), em que um volume de 1ml ou 0.1ml da amostra é pipetado e espalhado na 
superfície do meio de cultura sólido com auxílio de uma alça de Drigalski. 
A segunda técnica, designada por Sementeira por incorporação (Pour plate) consiste na mistura de 1 
ou 0.1ml da amostra diluída com o meio de cultura ainda no estado líquido. Após o período de incubação, 
quando se deseja realizar a contagem do número de unidades formadas de colônia (UFC), o ideal é que a 
placa apresente de 25 a 250-300 colônias. 
 
 
 Alguns procedimentos são indispensáveis para detecção e quantificação de diferentes microrganismos. 
Estas técnicas consistem de regras de assepsia e segurança para evitar a contaminação dos meios de cultura 
com microrganismos do ambiente; para obter culturas puras; para evitar acidentes laboratoriais. 
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1. A alça de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto, 
devem ser aquecidos no bico de Bunsen. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma 
faça um ângulo de 45° em relação à mesa de trabalho. 
2. Antes de retirar o material para a elaboração do esfregaço ou para semeadura deve-se esfriar a alça 
na parede interna do tubo ou na tampa da placa de Petri. 
3. Para a semeadura em tubos de ensaio, deve-se flambar rapidamente a boca dos mesmos logo após a 
retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está 
segurando a alça. Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e recolocar 
o tampão de algodão. Flambar a alça após o uso. Não pousar os tampões sobre a bancada. 
4. As placas de Petri deverão ser abertas próxima ao bico de Bunsen para evitar contaminação com 
germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em B.O.D. com tampa voltada para 
baixo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
CULTURA PURA: PURIFICAÇÃO E CONSERVAÇÃO DE CULTURAS 
 
PURIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS 
 
CULTURA PURA: Quando uma colônia isolada é transferida para um novo meio, as células se multipliquem 
livres de outras espécies de microrganismos. 
COLÔNIA: agregado de células idênticas. 
- OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS 
METODO DO ESGOTAMENTO DO INÓCULO EM SUPERFÍCIE DE MEIO SÓLIDO: 
• Estrias Simples 
1. Esterilize a alça de repicagem em Bico de Bunsen. Resfrie e colete uma pequena porção da 
suspensão contendopopulações microbianas mistas. 
2. Transfira assepticamente a suspensão microbiana contida na alça de repicagem para a superfície do 
meio. Espalhe vigorasamente o inóculo contido na alça de repicagem sobre a superfície do meio 
fazendo movimentos em zig zag: 
 
 
 
 
 
 
• Estrias Compostas 
Divida a placa em 4 quadrantes. Espalhe o inóculo no 1º quadrante, esgotando com a alça de 
repicagem, fazendo-se movimento de zig-zag. Flambe novamente a alça e esfrie encostando a alça de 
repicagem na superfície do ágar. Gire a placa 90 graus, toque a alça no canto da estria do 1º quadrante e 
deslize várias vezes, repedindo o movimento de zig-zag até o outro extremo do 2º quadrante da placa. Repita a 
operação no 3º e 4º quadrantes. 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
Técnicas de armazenamento de microrganismos 
 
Armazenamento por até 1 mês 
 
Repicar o microrganismos em placas de Petri, contendo meio espécifico. Cultivar na temperatura e período 
adequado para cada espécie, vedar a placa com filme PVC. Manter no refrigerador a 4ºC. Esta técnica é 
indicada para fungos e bactérias. 
 
Armazenamento por até 1 ano 
 
Repicar o microrganismo em microtubos hermeticamente fechados e em frascos (tampados com rolha de 
borracha) contendo 2/3 do volume com meio de cultura. Deve-se evitar o ressecamento do meio. Manter no 
refrigerador a 4ºC. Esta técnica é indicada para fungos e bactérias. Da mesma maneira, podem ser usados 
tubos de ensaio com meio de cultura inclinado e vedados com rolhas ou filme PVC. 
 
Armazenamento de 1 a 4 anos 
 
Óleo mineral 
 
Adicionar óleo mineral sobre microrganismos cultivadas sobre meio sólido inclinado, descritos anteriormente e 
mantê-los a temperatura ambiente. Esta técnica é indicada para fungos e bactérias. 
 
Método de Castelani 
Nesta metodologia, o microrganismo deve ser cultivado em meio sólido e posteriormente, fragmentos do meio 
de cultura contendo pedaços da colônia devem ser retirados e colocados em frascos contendo água 
esterilizada. Manter em temperatura ambiente. 
 
Congelamento 
 
As culturas também podem ser armazenadas por períodos mais longos em congeladores (freezers) – 80ºC. Os 
isolados devem ser cultivados em meio líquido, suplementado com o crioprotetor e amostras devem ser 
distribuídas em tubos criogênicos, a fim de evitar que, durante o congelamento, ocorra danos à estrutura das 
células e conseqüente comprometimento da viabilidade das mesmas. Para crioproteção, a cultura microbiana 
23 
 
deve ser suplementada com 7-8% de dimetilsulfóxido (DMSO) ou 15-25% de glicerol antes do congelamento a 
-80ºC. Para o armazenamento a -20ºC, devem ser utilizadas concentrações de 40-50% de glicerol. 
 
Armazenamento por 1 a mais de 4 anos 
 
Liofilização 
 
As células microbianas são liofilizadas, mantendo a viabilidade por longos períodos. Manter no refrigerador a 
4ºC. 
 
Sílica 
 
Faz-se uma suspensão de esporos em uma solução de leite (5%). 100 µl da suspensão são adicionados a um 
tubo (2 ml) mantida a 0ºC (no gelo) contendo sílica previamente esterilizada. Manter no refrigerador a 4ºC ou 
temperatura ambiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
PREPARAÇÕES E OBSERVAÇÕES MICROSCÓPICAS A FRESCO, FIXADAS E CORADAS 
(COLORAÇÃO GRAM). 
 
Introdução 
 A visualização de bactérias, fungos, leveduras só é possível com auxílio de microscópios óticos, que são 
instrumentos capazes de ampliar o tamanho de estruturas pequenas (impossível de visualizar a olho nu) através de um 
conjunto de lentes. Existem duas técnicas que permitem a preparação de material para observação de células com 
auxílio do microscópio ótico. A primeira, preparação microscópica a fresco, a suspensão dos micro-organismos pode ser 
examinada viva com auxílio ou não de corantes vitais, ideal para observar viabilidade, motilidade, tamanho e forma 
natural. Na outra, preparação microscópica fixada, a camada de suspensão dos micro-organismos é fixada pelo calor e 
corada com corantes específicos, para visualizá-los e diferenciá-los em grupos para estudos. As preparações fixadas 
podem ser ainda utilizadas para coloração simples, que usa um único corante, útil para visualizar forma e arranjo e, 
também para a coloração diferencial que utiliza mais de um corante e reagentes químicos, que permitem visualizações 
de flagelos, cápsulas, esporos e a separação dos micro-organismos em grupos. A coloração diferencial mais importante 
é a coloração de Gram, que separa as bactérias em dois grupos: Gram-positivo e Gram-negativo, importante para 
classificação e identificação das bactérias. 
 
Objetivo 
Preparar lâminas a fresco e fixadas. Realizar a coloração de Gram para diferenciar as bactérias em dois 
grandes grupos. Observar as formas, arranjos, cor, tamanho das células dos micro-organismos. 
 
Material 
Micro-organismos: cultura de bactérias, leveduras 
Soluções: água, fucsina ou safranina, cristal violeta, lugol (solução de iodo), álcool 
Equipamento e utensílios: microscópio ótico, lâminas, lamínulas, alça de repicagem, bico de Bunsen 
 
Procedimento 
Uso do Microscópio ótico 
1. Verifique a voltagem antes de ligar o equipamento; 
2. Gire o revólver, colocando em posição a objetiva de menor aumento (4X); 
3. Coloque a lâmina sobre a platina, com a preparação para cima, e prenda-a com a presilha; 
4. Movimente o charriot de modo que o esfregaço fique em baixo da objetiva 
5. Acenda a luz; 
6. Regule a quantidade de luz utilizando o diafragma e o condensador; 
7. Com o parafuso macrométrico eleve a platina ate o seu ponto máximo; 
8. Olhando pela ocular abaixe lentamente a platina com o parafuso macrométrico até que o material a ser 
observado possa ser visualizado; 
9. Ajustar o foco apenas com o botão micrométrico; 
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10. Encaixe a objetiva de 10X e ajuste o foco novamente, apenas com o botão micrométrico (uma vez que se tenha 
obtido o foco com a objetiva de 4X, acertar o foco das outras objetivas, 10 X, 20X, etc apenas com o botão 
micrométrico; 
11. Antes de encaixar a objetiva de 100X (objetiva de imersão) colocar uma gota de óleo de imersão sobre o 
esfregaço e encaixar a objetiva. Após a adição do óleo de imersão não voltar para a objetiva de 40 X; 
12. Após o término das observações, retirar a lâmina, desligar a lâmpada, girar o revolver e encaixar a objetiva de 
4X, baixar a platina e limpar a objetiva de imersão, cuidadosamente. 
 
Preparações Microscópicas a Fresco: 
1. Sobre a lâmina limpa e seca, coloque uma gota do material a ser examinado; 
2. Cubra a gota com a lamínula encostando um dos bordos da lamínula na gota, deixando descer suavemente, 
evitando a formação de bolhas de ar entre a lâmina e a lamínula; 
3. Focalize no microscópio e observe o material. 
 
Preparações microscópicas fixadas: 
1. Pegue uma lâmina limpa e seca e flambe-a com o bico de Bunsen e deixe esfriar; 
2. Transfira, assepticamente, com auxilio da alça de repicagem e bico de bunsen, uma gota da cultura de bactérias 
em meio líquido ou raspe, levemente, a superfície do Agar caso a cultura esteja em meio sólido, transfira sobre 
a lâmina já contendo uma gota d’água; 
3. Esfregue com movimentos circulares a suspensão, apenas na área central da lâmina; 
4. Deixe secar ao ar; 
5. Fixe o esfregaço, passando a lâmina 3 vezes acima da chama do bico de Bunsen (o lado do esfregaço fica para 
cima), deixe esfriar; 
6. Faça a coloração do material com o corante específico; 
7. Lave o esfregaço com água; 
8. Seque ao ar; 
9. Focalize no microscópio e observe o material. 
 
Coloração Diferencial: Coloração de Gram: 
1. Prepare um esfregaço, transferindo assepticamente uma porção da cultura da bactériaem meio sólido para uma 
lâmina contendo uma gota d’água destilada. Utilizando a alça de repicagem faça movimentos circulares para 
formar uma suspensão na área central da lâmina; 
2. Fixe o esfregaço, passando 3 vezes a lâmina sobre o bico de Bunsen. Deixe esfriar; 
3. Coloração de Gram: cubra o esfregaço com o corante cristal violeta por 1 min, em seguida, com o auxílio da 
piseta, lave com água destilada; 
4. Cubra o esfregaço com a solução lugol por 1 min, lave com água; 
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5. Lave a lâmina com etanol 95 % rapidamente (até que não se desprenda mais corante do esfregaço); 
6. Lave o excesso de álcool com água; 
7. Cubra o esfregaço com solução de fucsina, por 30 segundos; 
8. Lave a lâmina com água e deixe secar; 
9. Faça a observação ao microscópio do material. 
 
Resultados 
Desenhe os campos observados, observando forma, tamanho, arranjos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ISOLAMENTO DE FUNGOS DE PLANTAS COM SINTOMA DE DOENÇA 
 
O isolamento de fungos causadores de doenças de plantas é uma etapa fundamental para a 
identificação e para estudos deste patógeno e da interação planta-patógeno. Através da cultura pura pode-se 
ter melhor entendimento do patógeno como, requerimentos nutricionais, reprodução, substâncias resultantes 
do metabolismo e, também, a interação do patógeno-planta. Para obter-se a cultura pura do patógeno é 
necessário fazer o isolamento a partir de uma amostra com sintoma de doença, podendo ser diretamente a 
partir da transferência de esporos ou micélio para o meio de cultura ou indiretamente, a partir de fragmentos de 
tecido foliar contendo estruturas fúngicas transferidos para meio de cultura. 
Esta aula tem como objetivo o treinamento de técnicas de isolamento de microrganismos de plantas 
com sintomas de doenças. 
 
Isolamento direto: 
Procedimento: 
1. Recolha, com alça de repicagem, esporos ou micélio de fungos da superfície da planta com sintomas 
de doença; 
2. Transfira os esporos para a superfície do meio BDA em placa de Petri; 
3. Incube as placas à temperatura ambiente por uma semana. 
4. Após crescimento do microrganismo de interesse, transfira a colônia para um novo meio de cultura e 
armazene a sua cultura pura. 
 
Isolamento indireto: 
Procedimento: 
1. Escolha no material vegetal os locais que apresentam lesões recentes, para evitar que organismos 
saprófitos dificultem o isolamento do patógeno; 
2. Lave o material em água corrente e seque o mesmo em papel absorvente; 
3. Com uma lâmina, corte fragmentos de 1 a 3 mm das partes lesadas, tendo cuidado para também, incluir 
porções saudáveis do tecido; 
4. Embeba os fragmentos em álcool a 70 % por 30 segundos, para quebrar a tensão superficial e iniciar a 
descontaminação superficial do material vegetal; 
5. Com o auxílio de uma pinça, transfira os fragmentos para uma placa de Petri contendo solução de 
hipoclorito a 1 %, por aproximadamente, 30 segundos; 
6. Com pinça previamente flambada, retire fragmentos da solução de hipoclorito, lave-os em água estéril e 
seque-os em papel de filtro esterilizado; 
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7. Com o auxílio de uma pinça, transferia os fragmentos, bem separados, sobre a superfície do meio BDA 
(batata dextrose Agar); 
5. Incube as placas à temperatura ambiente por uma semana. 
6. Após crescimento do microrganismo de interesse, transfira a colônia para um novo meio de cultura e 
armazene a sua cultura pura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PREPARAÇÕES E OBSERVAÇÕES MICROSCÓPICAS DE FUNGOS 
 
INTRODUÇÂO 
Os fungos são organismos eucarióticos, heterotróficos, aeróbios, adaptados a diversos 
ambientes. Apesar de abundantes em todo o mundo passam despercebidos em função do 
pequeno tamanho das suas estruturas, sendo notados apenas quando frutificam, a exemplo, os 
bolores e os cogumelos. Desempenham papel importante na decomposição da matéria orgânica, 
na ciclagem de nutrientes, na indústria alimentícia (fermentação, enzimas), na indústria 
farmacêutica (antibióticos) e são responsáveis pela causa de doenças em plantas e seres 
humanos. Os fungos podem existir como saprófitas degradando matéria orgânica, transformando-a 
em formas químicas simples que retornam ao solo; como parasitas causando doenças em animais 
e vegetais e como simbiontes que associam com outros organismos, tal como algas (liquens) e 
raízes de plantas (micorrizas). A classificação dos fungos é baseada em suas estruturas 
reprodutoras, como esporos, corpos de frutificação, natureza do ciclo de vida e características 
morfológicas do seu ciclo de vida. Os fungos formam esporos e produzem hifas que são estruturas 
filamentosas e cilíndricas que a partir de seu crescimento formam um micélio bem desenvolvido. 
Nesta aula você fará observações microscópicas de alguns fungos, visualizando suas estruturas, 
como esporos e hifas. 
 
MATERIAL 
Cultura de Penicillium sp., Aspergillus sp., Curvularia sp. , Phyllosticta sp., Trichoderma sp.; 
lâminas, lamínulas, lactofenol, microscópio ótico, alça de repicagem. 
 
PROCEDIMENTO 
Preparações Microscópicas 
1. Com o auxílio de uma alça de repicagem, remova uma parte do micélio do fungo em cultura 
pura; 
2. Transfira a amostra coletada uma lâmina contendo 1 gota de azul de lactofenol; 
3. Cubra com a lamínula; 
4. Observe e desenhe as estruturas dos fungos. 
 
 
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Esquematize as observações microscópicas das amostras dos fungos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA DE MICRO-ORGANISMOS E TESTES DE ANTIBIOSE 
 
Os sistemas de produção agrícola têm se tornado cada vez mais intensivos e dependentes dos 
agroquímicos, o que tem gerado problemas com o desenvolvimento de resistência dos patógenos aos produtos 
utilizados e impactos ambientais negativos devido ao amplo espectro de ação destes produtos, atingindo 
organismos não-alvo e causando riscos à saúde humana e animal. Neste sentido, a utilização de micro-
organismos com ação de biocontrole e/ou promoção de crescimento vem sendo apontada como uma 
alternativa viável para sistemas de produção agrícola ecologicamente e economicamente sustentáveis. 
Dentre as avaliações realizadas in vitro para a seleção de agentes de controle biológico e promoção de 
crescimento de plantas, características como atividade antagônica ao patógeno (antibiose), capacidade de 
colonização do sistema radicular, produção de sideróforos, enzimas líticas e substâncias reguladoras de 
crescimento de plantas, entre outros são de fundamental importância. 
Produção de quitinase 
Os micro-organismos são multiplicados em meio de sais minerais ágar (Tuite, 1969), suplementado com 
quitina coloidal, como única fonte de carbono. As culturas são incubadas em câmara de crescimento tipo 
B.O.D., a 28±2ºC por dez dias. Após esse período, a atividade quitinolítica dos isolados é avaliada pela 
formação de um halo hialino em torno das colônias crescidas. 
Produção de celulase e xilanase 
Os micro-organismos são multiplicados em meio de sais minerais ágar (Tuite, 1969), suplementado com 
celulose ou xilana, como única fonte de carbono. Os micro-organismos são incubados em câmara de 
crescimento tipo B.O.D., 28±2ºC por dez dias. Após esse período, são adicionados 10 mL da solução de 
vermelho congo a 0,5% em cada placa, seguido de incubação a temperatura ambiente por 15 minutos. Após 
esse período, é drenado o excesso da solução vermelho congo e adicionados 10 mL da solução deNaCl (1 M) 
em cada placa, seguido de incubação por 30 minutos. Após ter removido o excesso da solução, verifica-se a 
formação do halo de coloração alaranjada em torno das colônias crescidas, indicando a atividade celulolítica e 
xilanolítica dos isolados. 
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Produção de lipase 
A produção de lípase pelos isolados, é avaliada no meio de cultura usando Tween 80 como fonte de carbono. 
Os micro-organismos são incubados em câmara de crescimento tipo B.O.D., a 28±2ºC por dez dias. A 
produção da enzima é detectada pela formação de um halo branco difuso, constituído de minúsculos 
precipitados de oleato de cálcio, ao redor das colônias crescidas dos microorganismos. 
Produção de amilase 
Os micro-organismos são multiplicados no meio de cultura ágar amido, constituído de 0,2% de amido solúvel. 
Posteriormente, as culturas são incubadas em câmara de crescimento tipo B.O.D., a 28±2ºC por dez dias. 
Após o crescimento das colônias, foram adicionados 10 mL da solução de lugol nas placas. A produção da 
enzima amilase é detectada pela descoloração do meio em torno da colônia, devido à hidrólise do amido. 
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Solubilização de fosfato 
Os micro-organismos são cultivados em meio de cultura triptocaseína de soja, diluído 1/10 e acrescido de 
CaHPO4, e as placas incubadas em câmara de crescimento tipo B.O.D., a 28±2ºC, por dez dias. Após esse 
período, a solubilização de fosfatos é detectada pela formação de halo claro em torno das colônias crescidas. 
 
 
 
TESTES DE ANTIBIOSE 
34 
 
Método metabólito em meio de cultura 
Alíquotas de 10 ml de metabólitos do micro-organismo antagonista é transferida para Erlenmeyers com 
capacidade para 250 mL, contendo 90 mL de BDA fundente (aproximadamente 70oC). O meio é vertido para 
placas de Petri (20 ml/placa), e após solidificado é transferido discos de 0,5 cm de diâmetro do fungo 
fitopatogênico, retirado da borda de cultura com oito dias de cultivo para o centro das placas. A testemunha 
consiste de placas de Petri contendo o meio BDA, com o fungo fitopatogênico e sem metabólitos do micro-
organismo antagonista. Com auxílio de uma régua milimetrada, é medido o crescimento micelial do fungo 
diariamente. Quando o fungo ocupar toda a placa no tratamento testemunha é paralisada a medição. 
 
Método do pareamento em risca 
O micro-organismo antagonista é riscado no centro de uma placa contendo meio BDA. Posteriormente, é 
adicionado na placa 2 discos de 0,5 cm do fungo fitopatogênico, com 8 dias de cultivo. Se for testado como 
microrganismo antagonista actinomiceto, a placa deverá ser incubada em B.O.D. por 5 dias. Com auxílio de 
uma régua milimetrada, é medido o crescimento micelial do fungo diariamente. Quando o fungo ocupar toda a 
placa no tratamento testemunha é paralisada a medição. 
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36 
 
COLORAÇÃO DE RAÍZES (COLONIZAÇÃO MICORRÍZICA) E EXTRAÇÃO DE 
ESPOROS 
 
As micorrizas arbusculares (MA) são associações entre plantas e fungos do solo do filo Glomeromycota. 
O benefício da associação para a planta surge do aumento da extensão da superfície de absorção e, em troca, 
o fungo é subsidiado por carboidratos fotoassimilados. A colonização radicular pelos fungos micorrízicos 
arbusculares (FMA) é restrita às células do córtex, não invadindo o cilindro central, sendo, portanto, incapaz de 
causar qualquer dano às raízes, caracterizando, deste modo, uma associação simbiótica. 
Os FMA exercem grande influência na estruturação das comunidades vegetais, promovendo o aumento 
na absorção de nutrientes, também aumentam a tolerância das plantas a doenças radiculares influenciam a 
diversidade e a produtividade vegetal, e favorecerem a comunicação de duas ou mais plantas através das 
hifas fúngicas. 
 
Avaliações da ocorrência de FMA em solos 
 
Colonização micorrízica 
 
Raízes finas (< 2mm) são lavadas repetidas vezes em água destilada e, em seguida, imersas em 
solução de KOH 10% + H2O2 (na proporção 1:3) até ficarem claras. Após esse período, são lavadas com água 
corrente, e imersas em solução de HCl 1% por 3 minutos. Posteriormente, são imersas em solução de azul de 
trypan 0,05% lactoglicerol por 24 h, em temperatura ambiente. Após este período, devem ser conservadas em 
lactoglicerol ácido, até avaliação. Para avaliação da percentagem de colonização micorrízica, fragmentos de 
raízes coradas são transferidos para placa quadriculada (quadrículas de 1,27 cm) e observados em 
microscópio estereoscópico (40x), sendo contados 100 segmentos de raiz que fizerem interseção com as 
linhas verticais e horizontais e registrando-se o número de segmentos colonizados. São considerados 
colonizados, os segmentos de raízes que apresentarem estruturas típicas de fungos micorrízicos, tais como 
vesículas, arbúsculos, hifas e pelotões. 
 
 
COLORAÇÃO DE RAÍZES (Koske & Gemma, 1989) 
 
Procedimento: 
• Separar 1 g de raízes; 
• Colocar as raízes em mistura KOH 10% + H2O2 10% (proporção 1:3) durante 45 minutos a temperatura 
ambiente; 
• Lavar as raízes; 
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• Colocar as raízes em HCl 5% por 5 minutos; 
• Colocar as raízes em azul de metila 0,05% por 24 horas; 
• Conservar as raízes coloridas em glicerol ácido até avaliação. 
 
Preparo dos reagentes: 
HCl (Ácido clorídrico) - 5% 
132 ml de HCl P.A. (38%) em 950 ml de água destilada 
 
KOH (Hidróxido de sódio) – 10% 
Peso molecular 56,11g 
100 g de KOH dissolver em 900 ml de água destilada 
 
Peróxido de hidrogênio – 10% 
345 ml de peróxido de hidrogênio P.A. (28%) completar para 1000 ml com água destilada. 
 
Azul de metila – 0,05% 
• 200 ml de ácido lático 
• 200 ml de água destilada 
• 200 ml de glicerol 
• 0,3g de azul de metila 
 
Glicerol ácido 
• 250 ml de glicerol 
• 15 ml de HCl - 5% 
• 85 ml de água destilada 
 
 
AVALIAÇÃO DA COLONIZAÇÃO MICORRIZICA (Giovannetti e Mosse, 1980). 
 
Procedimento: 
• Espalhar as raízes coloridas uniformemente em placa quadriculada (quadrículas de 1,27 cm); 
• Registrar o número de segmentos radiculares que fazem interseções com linhas verticais e horizontais e 
destes quais apresentam estruturas do fungo (vesículas, arbúsculos, células auxiliares, esporos ou hifas) 
 
 
 
 
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Referências 
GIOVANNETTI, M.; MOSSE, B. An evaluation of techniques to measure vesicular-arbuscular mycorrhizal 
infection in roots. New Phytologist, v.84, p.484-500, 1980. 
KOSKE, R.E.; GEMMA, J.N.A. modified procedure for staining roots to detect mycorrhizas. Mycological 
Research. v. 48, p. 486-488, 1989. 
 
Densidade de esporos de FMA 
 
Para extração de esporos de FMA 50 g de solo é transferida para um recipiente contendo 1000 ml de 
água, homogeneizados com a mão para desestruturação de todos os torrões (aglomerados) existentes. Na 
seqüência, o material é decantado por um minuto, sendo o sobrenadante vertido sobre três peneiras 
sobrepostas de 50µm, 100µm e 250µm. O material retido nas peneiras éi recolhido em um tubo de ensaio e 
submetido à centrifugação em água (3000 rpm) por 3 minutos. O sobrenadante é descartado e, ao material 
depositado no fundo, foi adicionada solução de sacarose 70%. O material é ressuspenso com auxílio de bastão 
de vidro e os tubos de ensaio são novamente levados à centrífuga (2000 rpm) por 1 minuto. O sobrenadante é 
vertido na peneira de 50µm e os esporos retidos na mesma foram lavados em água corrente para retirada do 
excesso de sacarose, e transferidos para placa canaletada, onde é realizada contagem com auxílio de 
microscópio estereoscópico (40x). 
 
 
 
 
EXTRAÇÃO E CONTAGEM DE ESPOROS DE FMA 
 (Gerdemann & Nicolson, 1963) 
 
Procedimento: 
 
• Colocar 50 g de solo em recipiente com 1000 mL de água e agitar, deixar repousar por alguns segundos; 
• Passar em peneirasde malhas 40 e 400 mesh; 
• Recolher o material retido na peneira de 400 mesh e transferir com auxílio de pisseta com água destilada 
para tubos de centrífuga; 
• Centrifugar material durante 5 minutos a 3000 rpm; 
• Descartar sobrenadante e adicionar solução de sacarose 50% até completar tubo; 
• Agitar e centrifugar o material durante 2 minutos a 2500 rpm; 
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• Recolher o sobrenadante com peneira de 400 mesh; 
• Lavar com água corrente para retirar excesso de sacarose; 
• Transferir o material retido na peneira para placa de Petri; 
• Levar ao estereomicroscópio para contagem dos esporos. Serão considerados viáveis ou esporos que 
adquirem coloração vermelha ou rósea após contato com o reagente 
 
Preparo das soluções: 
 
Solução de sacarose - 45% 
 
Colocar 500g de açúcar e completar para 1000 ml com água destilada. 
Essa proporção é sempre compatível com a quantidade de solução que se deseja preparar. 
 
GERDEMANN, J.W.; NICOLSON, T.H. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet 
sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, v.46, p.235-244, 1963.