Resumo Biologia Molecular

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BIOLOGIA MOLECULAR
MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS
- Complexidade genômica: o genoma humano possui cerca de 22000 genes, porém o proteoma possui cerca de 100000 proteínas. Existem fatores que geram diversidade proteica: processamento alternativo do pré-mRNA, edição do mRNA, modificações pós-traducionais. 
- Proteoma: conjunto de proteínas e variantes de proteínas expressas por um tecido ou célula em determinada condição.
- Processamento do RNA em eucariotos: 
Edição de mRNA: modificações no mRNA (pós-processamento) que alteram a tradução da molécula, resultando em formas distintas de proteínas. 
Desaminação sítio-específica: remoção de um grupo amina que altera a base do mRNA. Exemplo: gene apolipoproteína-B expresso diferencialmente no fígado e no intestino (desaminação tecido-específico).
- Modificações pós-traducionais: a cadeia polipeptídica só se torna funcional após assumir sua estrutura terciária, necessitando sofrer modificações após ser produzida pelo ribossomo: 
A cadeia polipeptídica necessita sofrer dobras: a sequência de aminoácidos de uma proteína determina sua estrutura tridimensional. O ambiente aquoso intracelular não favorece o dobramento correto e natural das proteínas, que conta com o auxílio de proteínas especiais: as chaperoninas formam complexos junto à cadeia polipeptídica nascente, denominados “máquinas de dobramento chaperoninas”. Forças estabilizadoras das proteínas: 
Interações iônicas: entre aminoácidos que possuem cargas opostas.
Interações hidrofóbicas: entre aminoácidos que não possuem carga; estabilizam o interior da proteína. 
Pontes de hidrogênio: formadas entre aminoácidos próximos ao longo da cadeia polipeptídica (constituem a estrutura secundária – hélices) e distantes, estabilizando as dobras.
Ponte dissulfeto: formada entre duas cisteínas, por uma reação de oxidação catalisada por enzimas específicas. São mais frequentes em proteínas secretadas para o meio extracelular, como a insulina.
A sequência exata de aminoácidos é crucial para que as interações ocorram corretamente.
Adição de grupos químicos aos aminoácidos:
Glicosilação: adição de açúcares (caboidratos) a aminoácidos específicos. Exemplos grupo sanguíneo ABO:
Adição de lipídios: adição de ácidos graxos que auxiliam ancorando proteínas transmembrana. Exemplo: adição de palmitoil ao átomo S da cisteína. 
Clivagens: a metionina inicial ocasionalmente é removida da estrutura primária de determinadas proteínas. Clivagens de sequências maiores de aa, nas extremidades e no interior da cadeia, também ocorrem durante a maturação das proteínas. Exemplo: insulina. 
A proteína pronta precisa ser conduzida ao seu destino: 
Peptídeo sinal: a proteína recém-sintetizada possui uma sequência curta de aa que sinaliza o local para onde ela deverá ser transportada (secretada, nuclear, acoplada à membrana, retículo endoplasmático, etc.).
Modificações pós-traducionais na cadeia polipeptídica da insulina:
Maturação da insulina: formação de pontes dissulfeto entre as cadeias A e B; clivagens do peptídeo sinal C.
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR IV – CLONAGEM GÊNICA
- Produção de moléculas de DNA recombinantes.
- Vetor de clonagem – características essenciais de um vetor:
Plasmídeo: DNA circular bacteriano extracromossômico.
Possuir uma origem de replicação.
Apresentar sítios únicos para clivagens por enzimas de restrição.
Conter uma marcação de seletividade (genes de resistência). 
- Etapas da clivagem de DNA:
Clivagem: tratamento da amostra de DNA e do vetor com a mesma enzima de restrição, gerando extremidades compatíveis. 
Ligação inserto+vetor: mistura do inserto com o vetor, interação das extremidades e ligação com a enzima ligase. Clivagem do DNA de interesse e do vetor com a mesma enzima de restrição com formação de extremidades coesivas:
Transformação: inserção do vetor (plasmídeo) no hospedeiro (célula de E.coli). Células de E. coli não possuem competência natural para absorver DNA exógeno. O tratamento com íons de cálcio (Ca2+) torna as células de E. coli temporariamente competentes para o recebimento de DNA do ambiente. A transformação em células quimicamente competentes não é muito eficiente. Poucas células incorporam apenas um vetor.
Plaqueamento – individualização e seletividade: distribuição das células transformadas em meio sólido contendo um antibiótico. Somente as bactérias que incorporam um plasmídeo possuem resistência para crescer no meio seletivo contendo o antibiótico. Cada célula contendo um fragmento de DNA diferente vai gerar uma colônia na placa. 
Extração plasmidal: obtenção do plasmídeo recombinante purificado, contendo inserto de interesse. 
Identificação e manipulação do fragmento de interesse - objetivos: 
Sequenciar o genoma: todas as colônias contém um inserto de interesse e cada colônia é cultivada separadamente para extração plasmidal e posterior sequenciamento dos insertos
Um gene específico: identificar a colônia que contém o inserto de interesse, hibridização semelhante ao Southern blot, utilizando uma membrana de nylon e sonda específica para o fragmento de DNA de interesse.
Expressão de uma proteína: inoculação e cultivo da bactéria recombinante, expressão do gene clonado para a produção da proteína de interesse.
- Clonagem em vetor de expressão: ligação do gene de interesse a um vetor de expressão.
O gene deve ser inserido na orientação correta: 
Apenas uma das fitas do inserto é codificante.
A fita codificante deve estar orientada depois do promotor. 
A clivagem do inserto com enzimas de restrição diferentes forma extremidades coesivas com sequências diferentes, tanto no inserto quanto no vetor, o que permite encaixar o inserto no vetor com a orientação do gene correta em relação ao promotor.
Promotor da célula hospedeira: é a RNA pol da bactéria que vai transcrever o gene; o promotor deve ser reconhecível por ela.
O vetor deve possuir RBS (em procariotos):
Tradução do mRNA procarioto: o mRNA procarioto possui uma sequência curta a montante do códon iniciador denominada sítio de ligação ao ribossomo (RBS) que sinaliza o local de ligação do mRNA ao ribossomo. Possuem certo grau de complementariedade com uma região do rRNA 16S. Posiciona corretamente o códon inicial AUG no sítio P do ribossomo.
Expressão da proteína pela bactéria:
Genes eucariotos necessitam do processamento do pré-mRNA, mecanismo ausente em procariotos. Deve-se clonar o cDNA (oriundo do mRNA maduro, sem íntrons).
O código genético é degenerado e organismos diferentes usam códons preferenciais diferentes. É necessário verificar o uso de códons preferenciais do organismo hospedeiro. Exemplo: na E. coli a trp e a met possuem apenas um códon, ou seja, utilizado 100%; possui dois códons de phe e os dois são utilizados; já a leu possui 6 códons, sendo que o preferencial é o CUG (55% mais usado).
Proteínas que necessitam de processamentos pós-traducionais (modificações, glicosilações)devem ser produzidas em um organismo eucarioto (Saccharomyces cerevisiae).
- Evolução da clonagem em vetor de expressão:
1982: produção da insulina humana recombinante em E. coli (anteriormente extraída de pâncreas bovino e suíno).
1987: produção da insulina humana recombinante em S. cerevisiae (anteriormente extraída de pâncreas bovino e suíno).
1985: produção de hormônio do crescimento (anteriormente extraído da glândula pituitária de cadáveres).
1986: produção da vacina contra hepatite B. Clonagem e expressão do antígeno viral HBSAg (anteriormente extraída do plasma de doadores infectados, seguido de inativação do vírus).
TRANSGENIA
Desenvolvimento de organismos geneticamente modificados (OGM) por meio de introdução de um gene de uma espécie diferente ou gene modificado da mesma espécie, no genoma de um organismo receptor. 
Aplicação na transgenia animal:
Transgenia e produção de proteínas e órgãos:
Produção de proteínas recombinantes: a produção de genes humanos em células de mamíferos é mais eficiente do que em seres unicelulares, devido aos processamentospós-traducionais. Exemplo: ovelhas geneticamente modificadas para produção do fator IX de coagulação sanguínea humana, onde o transgene humano se expressa nas glândulas mamárias ovinas; purificado do leite e usado no tratamento de hemofílicos. 
Produção de órgãos animais imunocompatíveis: criar animais cujos órgãos possam ser transplantados em humanos com baixa taxa de rejeição. Exemplo: suínos modificados geneticamente pela introdução de um gene de antígeno de superfície humano nas células do órgão a ser transplantado. 
Transgenia e pesquisa básica: 
Organismos modelo para doenças humanas: permitem compreender o funcionamento da proteína normal, a patogenicidade da doença e testar fármacos e métodos de terapia gênica. Exemplo: síndrome de Ellis van Crevel (doença autossômica recessiva), mutações nos genes EVC, onde os indivíduos afetados apresentam displasia esquelética com membros curtos, costelas curtas, polidactilia pós-axial e unhas e dentes displásicos. A figura mostra um modelo murinho onde ambos os alelos do gene EVC foram inativados e ilustra as características da doença.
Organismos modelo para cânceres humanos: nocaute de genes supressores de tumor, ativação de oncogenes. Permitem compreender as bases moleculares de certos tipos de câncer e testar tratamentos (terapia gênica). 
TÉCNINAS DE BIOLOGIA MOLECULAR V – SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE GENÔMICA
Sequenciamento de DNA: determinar a sequência de bases nitrogenadas que compões um fragmento de DNA:
PCR de fita simples: só uma das fitas é copiada.
Produção de vários fragmentos truncados de DNA, com tamanhos correspondendo a cada nucleotídeo da sequência. 
Separação desses fragmentos por eletroforese capilar: os fragmentos migram por tamanho através do capilar e, ao atingirem o laser, emitem fluorescência correspondente ao último nucleotídeo incorporado. A emissão de fluorescência é lida pelo detector e interpretada por um computador, gerando o eletroferograma.
Detecção de cada nucleotídeo de forma individual, marcação com fluorescências diferentes. 
Nucleotídeos terminadores de cadeia: desoxirribonucleotídeo possui OH no carbono 3’ permitindo adição de nucleotídeos. Di-desoxirribonucleotídeo possui ausência do OH-3’ e finaliza a adição de nucleotídeos (nucleotídeos terminadores de cadeia), porém podem ser incorporados a uma fita/cadeia de DNA em formação, pelo seu grupo fosfato no carbono 5’.
Sequenciamento de genomas: uma reação de sequenciamento normal processa com qualidade cerca de 600pb. Um cromossomo humano possui em média 150Mb. 
Como sequenciar um genoma? construção de uma biblioteca genômica: clivagem do DNA com enzimas de restrição→ clonagem dos fragmentos em vetores→ transformação→ obtenção individualizada dos fragmentos, para posterior sequenciamento.
Sequenciamento dos fragmentos clonados utilizando iniciadores específicos para o vetor de clonagem.
Montagem do genoma: sobreposição das sequências obtidas. Esta forma de sequenciamento produz uma quantidade de informação que corresponde a uma cobertura de dez vezes o tamanho do genoma, permitindo a sobreposição dos fragmentos para a montagem das sequências. 
Sequenciamento de genomas – análises de bioinformática:
Busca por genes: ORFs, sequências promotoras de genes, íntrons e éxons.
Genômica comparada:
Microarranjos de DNA: milhares de dezenas de milhares de sequências conhecidas (genes), imobilizadas em uma lâmina na forma de fita simples. Cada ponto da lâmina é mapeado e a sequência que ele contém é identificada. A molécula de fita simples permite realizar experimentos de hibridização em larga escala. Etapas: extração de mRNA→ RT-PCR para obter o cDNA→ marcação do cDNA com fluorescência→ hibridização com um microarranjo de DNA. Permitem comparar padrões de expressão gênica entre amostras: de diferentes tecidos, de organismos distintos, do mesmo tecido, normal ou com algum distúrbio genético e do mesmo tecido normal e cancerígeno.
TERAPIA GÊNICA
Modificação da expressão gênica das células de um paciente para conseguir um objetivo terapêutico.
Terapia gênica da linhagem germinativa (designer babies): modificações permanentes e transmissíveis que poderiam ser obtidas pela manipulação dos gametas, do zigoto ou do embrião em estágio inicial. Ex.: seleção de descendentes não portadores de doenças, melhoramento genético.
Terapia gênica somática: modificações em células ou tecidos específicos de um pacientes, as quais ficariam confinadas a ele (não transmissíveis para próximas gerações). Todos os protocolos atuais de terapia gênica são voltados para a terapia gênica somática.
- Tipos de terapia gênica:
Adição gênica: fornecer uma cópia gênica funcional que irá suplementar um gene defeituoso. 
Nem todos os genes são expressos em todos os tecidos. A deficiência localizada de um gene mutado pode ser consertada com a implantação de uma cópia normal Ex.: fibrose cística. 
Na terapia contra o câncer, poderia fornecer uma cópia normal de um gene supressor de tumor que seja defeituoso naquele indivíduo. 
Não se aplica para reposição de genes defeituosos atuantes durante o desenvolvimento embrionário, cujo dano irreversível já teria ocorrido ao organismo. 
Eliminação de mutação patogênica: restabelecer a função de um gene mutado ou manipular os sítios de splicing, evitando a inclusão de um éxon mutado. 
Se uma mutação gera um stop códon, a exclusão do éxon mutado passaria a incluir o restante da região codificante. Ex.: distrofia muscular de Duchenne e de Becker, onde diferentes mutações no mesmo gene da distrofina resultam em fenótipos marcadamente diferentes.
Na terapia contra o câncer, poderia restabelecer a função normal de um oncogene.
Exemplo da distrofia muscular: a distrofia do tipo Duchenne possui sintomas mais severos, como quedas frequentes, hipertrofia das panturrilhas, dificuldade de correr e até mesmo déficit cognitivo e dificuldade de aprendizagem, as manifestações ocorrem antes dos 5 anos. Já a distrofia do tipo Becker possui os mesmos sintomas, só que mais brandos e com manifestação tardia, a evolução clinica é mais lenta. 
O gene da distrofina possui 79 éxons, gerando uma proteína longa. A deleção dos éxons 45 e 55 gera uma mudança na fase de leitura dos códons a partir do éxon 55 e um stop códon. Logo, os éxons que codificam a região de ligação da proteína na membrana não são traduzidos, gerando uma proteína truncada e levando à distrofia do tipo Duchenne (DMD). Já na distrofia do tipo Becker (DMB), os éxons 45 à 53 são deletados e não há mudança na fase de leitura dos códons, apenas alguns éxons no interior do mRNA não são traduzidos. Isso gera uma proteína encurtada e leva a esse tipo de distrofia. 
A deleção que gera a DMB pode até ser maior, mas não altera a fase de leitura dos códons, os éxons finais são traduzidos e a distrofina perde uma parte de seus aminoácidos da parte mediana. A deleção na DMD altera a fase de leitura dos códons, interrompendo a tradução dos éxons finais do mRNA, fazendo com que a distrofina perca seu domínio de ligação com a membrana. 
A inclusão alternativa de éxon mediada por oligonucleotídeo antissenso pode restabelecer a função gênica. No splicing, um éxon contendo mutação danosa é incluído na sequência codificada. Um oligonucleotídeo antissenso é desenvolvido para parear com uma sequência regulatória do splicing; nesse caso a região aceptora do splicing do íntron que precede o éxon que carrega a mutação danosa. Protegendo a sequência de splicing da maquinaria de spliceossomo, o OA provoca a não inclusão éxon, resultando na não inclusão da mutação. O OA PR0051 induz o pulo sobre o éxon 51 do gene da distrofina, em causar mudança na fase de leitura traducional. Após a injeção intramuscular com PR0051, 4 pacientes com DMD contendo mutação com o éxon 51 mostraram evidências de recuperação da distrofina nas fibras musculares, como revelado na análise por imunofluorescência com anticorpos específicos contra distrofina. Os painéis inferiores são controles, sendo um paciente com DMD não tratado e um saudável.Inibição da expressão gênica: silenciamento da expressão de um gene cujo produto é danoso ou indesejado. 
Em doenças infecciosas, o alvo pode ser os genes do patógeno.
Silenciamento de oncogenes ativados durante o câncer.
Respostas indesejadas de doenças autoimunes. Ex.: alelos HLA que destroem as células pancreáticas e geram diabetes tipo 1. 
Silenciar um alelo mutante dominante em doenças hereditárias, já que os heterozigotos para a mutação possuem uma cópia do alelo normal.
Eliminação de células-alvo específicas: específico para tratamento do câncer. 
A introdução de um gene produtor de toxina desencadeia a destruição das células indesejadas. 
A introdução de um gene produz antígenos que provocam uma forte resposta imunológica para eliminar as células cancerosas (imunoterapia).
- Transferência de genes para as células de um paciente:
Terapia gênica in vivo: realizada diretamente no paciente, por meio de injeção em um órgão. Aplicável a órgãos cujas células não podem ser cultivadas ou reimplantadas de forma eficiente do individuo. Ex.: olho, cérebro, músculo.
Terapia gênica ex vivo: as células-alvo são retiradas do paciente, cultivadas e modificadas geneticamente, para posterior reintrodução. Aplicada às células-alvo acessíveis para remoção. Ex.: tecido hematopoiético, pele.
- Vetores: veículos de transporte do DNA para terapia gênica.
Vetores virais: eficientes em infectar células, inserem o material genético podendo integrar-se ao genoma da célula hospedeira. Possui expressão gênica duradoura, tropismo tecido-específico, facilitando o direcionamento ao alvo. A integração ao genoma pode inativar genes importantes ou ativar oncogenes da célula-alvo. Despertam reação imunológica ao organismo. Principais vetores virais:
Retrovírus: carregam o material genético na forma de RNA e possuem a transcriptase reversa para produzir cDNA que é integrado ao genoma, aleatoriamente. Capacidade de clonagem=7 a 8 kb. Ocorre integração com o genoma hospedeiro (transgenia duradoura), infecta somente células em divisão celular, indicado ara terapia de células cancerosas. 
Adenovírus: vírus de DNA causadores de infecções no trato respiratório superior (resfriados). Capacidade de clonagem=7,5 a 35 kb. Não ocorre integração com o genoma hospedeiro, expressão de transgenia transiente, porém em altos níveis. Infecta tanto as células em divisão celular quanto as que não estão em divisão. É possível especificar as células-alvo de determinados tecidos moldando as proteínas de superfície do vírus para o reconhecimento de proteínas da superfície de células-alvo. Desencadeia forte resposta imunológica do hospedeiro.
Vírus adenoassociado: vírus de DNA fita simples não patogênico. Necessita da coinfecção com adenovírus para promover sua replicação. Capacidade de clonagem máxima: 5 kb. Ocorre integração com o genoma hospedeiro de forma extremamente especifica no cromossomo 19 (posição 19q13.3). A alta especificidade da integração confere expressão duradoura da transgenia e elimina problemas de integração aleatória danosa. Entretanto, o gene viral que garante a especificidade (rep) é deletado durante a construção do vetor para evitar a multiplicação viral no hospedeiro. Infecta tanto as células em divisão celular quanto as que não estão em divisão; a especificidade ao tecido-alvo pode ser moldada pelas proteínas de superfície; desencadeia resposta imunológica do hospedeiro.
Vírus do herpes simples: vírus de DNA causadores de herpes labial e genital, com tropismo especial pelo SNC. Capacidade de clonagem máxima: 30 kb. Não há integração com o genoma hospedeiro, porém permanecem por longo período como DNA circular extra que se replica a cada divisão celular, garantindo sua expressão transgênica duradoura. O tropismo pelo SNC limita sua aplicação terapêutica. Garante especificidade na entrega e atuação do gene para doenças do SNC, como Parkinson e tumores.
Vetores não virais: mais seguros, o DNA nu ou associado a lipossomas é introduzido na célula via injeção ou biobalística. Não despertam reação imunológica; transferência gênica menos eficiente; expressão gênica fraca e não duradoura.
Lipossomas: vesículas sintéticas que se formam espontaneamente quando certos lipídeos (fosfolipídeos) são introduzidos em solução aquosa. Mimetizam a estrutura da membrana plasmática, com partes hidrofóbicas voltadas para dentro e as hidrofílicas em contato com a água. O DNA plasmidial, contendo o gene, é englobado pela vesícula. Não há limite de capacidade de clonagem nem limitação tecido-específica. Não causam resposta imune, embora alguns possam ser tóxicos; baixa eficiência da transferência gênica (entrada nas células); não são incorporados aos genomas (transgenia transiente). Alguns plasmídeos podem conter genes que conferem a capacidade de integração ao genoma, porém a eficiência é sempre inferior a do vírus. 
DNA NU: molécula de DNA plasmidial não associada a vetores (viral ou lipossômico). O DNA pode ser compactado em associação com polietileno glicol (PEG), formando nanopartículas que são injetadas nas células-alvo. Capacidade mínima: 20 kb. Pode ser associado a partículas de ouro; a introdução nas células-alvo pode ser feita por eletroporação (biobalística). Não causam resposta imunológica, baixa eficiência de transferência gênica, não são incorporados ao genoma.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Doenças infecciosas:
Objetivo: investigar com qual gene infeccioso a pessoa está.
Método: identificar a presença do DNA do agente infeccioso. Hibridização com sonda específica ou PCR com primers específicos.
Aplicação: tratar o indivíduo afetado com antibiótico adequado. 
Pré-requisito: conhecer a sequência de DNA (gene ou genoma) dos possíveis agentes infecciosos, para comparação com a amostra investigada.
Doenças genéticas: 
Objetivo: investigar qual mutação é responsável pelas alterações fenotípicas relacionadas à doença. 
Método: caracterizar as mutações no DNA do portador da doença através de várias técnicas.
Aplicação: descritiva, busca por medicação que resolva/amenize a falta da proteína ou o efeito na proteína, terapia gênica.
PCR para doenças infecciosas:
O PCR amplifica especificamente o gene do parasita. Ex.: detecção do vírus da Chikungunya, doença originária da Tanzânia e disseminada em países africanos e asiáticos, é transmitida pelo Aedes aegypti e já ameaça do continente americano.
Etapas: coleta de amostras de 6 pacientes suspeitos→ RT-PCR com primers para o gene do vírus (E2 é a proteína do envelope viral), o produto de amplificação esperado é 305 pb→eletroforese em gel de agarose→ interpretação do resultado: resultado positivo - banda do tamanho esperado no gel (3 e 4); resultado negativo – ausência de banda no gel (2, 5 e 6).
 
PCR amplifica um gene comum de várias espécies do parasita. Ex.: detecção do protozoário Barbesia (Barbesiose canina). Microscopia de esfregaço sanguíneo não permite diferenciar subespécies. Gene-alvo da PCR: 18S e 28S rRNAs, comuns em três subespécies de Barbesia: B. canis rossi - alta patogenicidade, infecção fatal; B. canis vogeli – média patogenicidade, infecção moderada; B. canis canis – baixa patogenicidade, infecção leve.
Etapas: coleta de amostras de sangue canino→ PCRs com diferentes conjuntos de primers: B1-B3 – 746pb canis; B1-B4 – 590pb vogeli; B1-B5 – 342pb rossi→ eletroforese em gel de agarose→ interpretação dos resultado→ tratamento adequado para cada paciente e controle de zoonose.
PCR para doenças genéticas:
Para detectar mutações do tipo deleção. Ex.: diagnóstico de fibrose cística (∆508). Etapas: coleta de DNA de indivíduos com sintomas→ PCR com primers para amplificar o gene CFTR: alelo normal – 98pb; alelo deletado – 95pb→ eletroforese em gel de acrilamida→ interpretação do resultado.
Doenças causadas por mutações do tipo substituição de um nucleotídeo. Ex.: mutações no gene da insulina humana causam diabetes neonatal. Mapeamento das substituições de aminoácidos, observadas na insulina humana, que causam diabetes. Mutação G-A no DNA→ troca de aminoácidosCys por Tyr→ insulina não funcional→ diabetes neonatal.
Técnica de diagnóstico de diabetes RFLP (polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição): encontrar uma enzima de restrição que reconheça especificamente a sequência no local onde ocorreu a mutação→ produzir uma enzima de restrição específica para este sítio→ southern blot. É uma técnica muito trabalhosa. 
 
Técnica de diagnóstico de diabetes PCR-RFLP (polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição de um produto de PCR): designar um par de primers específicos e amplificar por PCR a região que contenha a mutação→ clivar os produtos da PCR com a enzima de restrição EnzX
Técnica de diagnóstico de diabetes sequenciamento do DNA: designar um par de primers e amplificar por PCR a região que contenha a mutação→ sequenciar o produto da PCR usando apenas um dos primers. O sequenciamento é caro e depende de outros laboratórios.
Técnica de diagnóstico de diabetes SNPs: designar um iniciador com extremidade 3’-OH anelando antes do SNP→ PCR com ddNTPs marcados com fluorescência→ eletroferograma.
Apliações do diagnóstico da diabetes:
Descritivo: pesquisa básica, aplicação do diagnóstico.
Busca por medicações que resolvam/amenizem: administração de insulina, produção da insulina humana pela tecnologia de DNA recombinante.
Terapia gênica: inserir através de um vetor, uma cópia normal do gene nas células do indivíduo portador da doença, ou seja, introduzir uma cópia do gene normal da insulina nas células pancreáticas.