30 - Preparo de Meios de Cultura

Prévia do material em texto

MEIOS DE CULTURA
 
Os meios de cultura são substâncias ou soluções que proporcionam o desenvolvimento de um microrganismo ou mais. Há uma grande quantidade de meios utilizados no isolamento, na manutenção e na propagação de culturas puras de bactérias e de fungos fitopatogênicos. Um meio adequado para o desenvolvimento de fitopatógenos deve incluir fontes disponíveis de carbono, de nitrogênio, de sais inorgânicos, e, dependendo do microrganismo, até mesmo de vitaminas (ex. biotina = vitamina H) e de outros fatores de crescimento (aminoácidos).
Com os meios de cultura estudam-se a morfologia, fisiologia, e influência de diversos fatores sôbre o desenvolvimento dos agentes patogênicos, e outros fatos com eles relacionados.
Os caracteres culturais (consistência, diâmetro, elevação, aspecto geral e cor das colônias, tipo de desenvolvimento, etc.) e fisiológicos (desenvolvimento em meios de composição diversa, digestão da caseína, efeito sôbre os açúcares, etc.) de certos microrganismos em diferentes meios de cultura, constituem elementos para a sua determinação específica.
Os meios de cultura de acordo com seu estado são classificados em: líquidos, sólidos e semi-sólidos e quanto a composição em: sintéticos, semi-sintéticos e naturais. No geral os meios líquidos são menos usados que os sólidos, por serem mais difíceis de lidar e mais sujeitos a contaminações.
As culturas líquidas são usadas para aumentar o inóculo de bactérias e fungos raramente são usadas para fins de identificação porque poucos fungos esporulam bem nestas soluções. Os microrganismos em cultura líquida podem ser cultivados em meio parado (estacionário) ou em meio agitado, através de um aparelho de agitação contínua (Figs. 1, 2, e 3). A agitação proporciona aeração e uniformidade no processo de desenvolvimento do microrganismo.
Os meios sólidos, normalmente, são utilizados no isolamento de bactérias e fungos para fins de identificação e de preservação de culturas. São preparados acrescentando-se agar (normalmente 1,5%, embora, possa usar-se 0,75 a 2%) aos outros componentes dos meios de cultura. O agar é um polissacarídio complexo obtido de algas e, básicamente, não tem nenhum valor nutritivo.
O agar possui propriedades bastante útil de formar um gel relativamente claro abaixo de 40(C. Funde-se a 80 - 100(C e tolera as altas temperaturas de esterilização sem se destruir.
 FIG. 1 Agitador de Kline FIG. 2. Agitador Magnético FIG. 3. Mesa Agitadora
MEIOS SINTÉTICOS: São aqueles constituídos de ingredientes cuja composição e concentração química são conhecidos. Esses meios são úteis nos estudos fisiológicos, quando se torna necessário repetir exatamente um lote anterior do meio ou registrar os efeitos da retirada ou do acréscimo de determinada substância.
Exemplo de meio sólido sintético
AGAR NUTRITIVO
	Peptona
	 5 g 
	Extrato de carne
	 3 g 
	Cloreto de sódio 
	 1 g
	Agar
	 15 g
	Água
	1000 ml
MEIOS SEMÍ-SINTÉTICOS: Os meios semí-sintéticos assemelham-se aos meios sintéticos quanto a possuírem um conjunto conhecido de ingredientes, porém apresentam a diferença de que, pelo menos alguns dos ingredientes, são de composição desconhecida ou variável. Um meio sintético, no qual todos os ingredientes são definidos químicamente pode ser transformado em semí-sintético, acrescentando-se determinada substância, como extrato de levedura. Sabe-se que o extrato de levedura contêm certas vitaminas, mas desconhecem-se as quantidades exatas ou a existência de outras substâncias que podem estar presentes. O resultado é um meio cuja composição é relativamente previsível, porém não é completamente conhecida químicamente. Os meios semí-sintéticos são amplamente utilizados nos trabalhos de rotina e oferecem opção entre os meios sintéticos e os naturais.
Exemplo de meio sólido semi-sintético
	Triptona
	 5 g
	Extrato de Levedura
	 2,5 g
	Glicose
	 1 g
	Agar
	 15 g
	Água destilada esterilizada
	1000 ml
 
MEIOS NATURAIS: Os meios naturais são compostos, parcial ou integralmente, com produtos naturais, como partes de plantas (folhas, brotos, raízes, sementes, etc.) ou de infusões ou de extratos de materiais de origem vegetal ou animal. Um pedaço de batata é um meio de cultura natural, assim como são um pedaço de pão ou de carne. os meios naturais normalmente, são muito bons e proporcionam a esporulação de fungos que, de outra forma, poderia não ocorrer.
Os extratos de várias frutas e de hortaliças são meios satisfatórios para os patógenos. O caldo de ameixa é especialmente favorável para a germinação de esporos. Entre os extratos mais comumente usados estão: feijão de corda, ervilha, farinha de milho, arroz, batata, malte e raízes de beterraba. Recomenda-se cerca de 50 g de peso seco do material vegetal para cada 1000 ml de água. Nesta base, deve-se usar cerca de 490 g de raíz de beterraba, 400 g de feijão corda ou 120 g de ameixa seca para 1 litro de meio de cultura.
Nem todos os microrganismos, entretanto, podem ser cultivados em meios de culturas. Os chamados parasitas obrigatórios não crescem em meios artificiais de cultura. 
INFUSÃO DE FRUTAS SECAS 
	Frutas secas (ameixeira, uva, pêra)
	 120 g
	Água 
	1000 ml
Macerar as frutas em água - > ferver por meia hora - > filtrar -> colocar em frascos -> esterilizar. 
Meio preparado em aula prática
BDA
	Batata
	 140 g
	Dextrose
	 10 g
	Agar
	 20 g
	Água destilada esterilizada
	1000 ml
 
1. Cozinhar a batata em 500 ml de água, extrair todo o decoto.
2. Fundir o agar mais dextrose em 500 ml de água, em autoclave ou banho-maria.
3. Juntar as partes 1 e 2.
4. Distribuir o meio em tubos ou frascos de cultura.
5. Esterilizar.
 A alteração do pH do meio impede o desenvolvimento de certos microrganismos. A maioria dos fungos cresce melhor em condições ácidas (pH 5,5 – 6,0) enquanto que o crescimento de bactérias é, geralmente, favorecido por condições aproximadamente neutras (pH 6,0 - 8,0).
 O meio usado pode ser ajustado para um pH ótimo, com vistas ao cultivo de bactérias ou de fungos antes da esterilização. Para tornar o meio ácido ou alcalino num nível desejado, acrescentar ácido clorídrico (HCl) ou Hidróxido de sódio (NaOH), 
 respectivamente, gota a gota não esquecendo de que são necessários 1 a 2 minutos para a estimativa correta do pH final. 
 Existem diversos tipos de aparelhos (tais como peagâmetros figs. 4 e 5), e ainda os papeis indicadores, que consistem em tiras de papel, que tomam cores diversas, conforme o pH do meio em que é mergulhado. Na caixa vêem impressos as cores correspondentes às diferentes reações do meio (fig. 6), para determinar o Ph.
 
 FIG. 4. Peagâmetro portátil FIG. 5. Peagâmetro de bancada FIG. 6. Papel indicador
 A distribuição do meio nos tubos de cultura, enrelmaiers e outros frascos, é feita com o funil distribuidor (Fig. 7) e ainda com o auxílio do funil Roux , no qual o meio de cultura é mantido fundido por aquecimento da água existente, em torno do funil de vidro (Fig. 8). 
 
 FIG. 7. Funil de Vidro FIG. 8. Funil de Roux
 Os meios são distribuídos na proporção de mais ou menos 10 cc. em cada tubo, ou 50 cc. para os enrelmaiers. Ao distribuir os meios deve-se evitar bezuntar a boca dos tubos de cultura. Depois de receberem o meio de cultura, os tubos ou frascos são fechados com um tampão de algodão. Estes devem ser bem colocados de modo que não sejam nem muito pequenos, nem demasiados frouxos; precisam ser suficientementejustos, no tubo ou erlenmaier, e terem uma parte bastante longa para fora, de modo a permitir a apreensão e fácil retirada durante as manipulações das culturas nas várias fases de repiques e semeaduras.
 Após a esterilização, e antes que o meio solidifique, os tubos são retirados do autoclave e colocados a esfriar, inclinados ou não (fig. 9), se inclinados ver procedimento como mostra a figura 10. 
 Fig. 10. Tubo com Agar inclinado
 Fig. 9. Tubos com Agar Inclinado e reto
 Os meios de cultura que põem em evidência determinadas propriedades úteis a identificação de diferentes espécies são chamados de diferenciais. Aqueles que permitem a dominância absoluta do organismo de se quer isolar de seletivos.
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�