32 - Esterilizacao

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ESTERILIZAÇÃO
1. INTRODUÇÃO
Os microrganismos são encontrados em todos os lugares: no ar, no solo, nas roupas, nos cabelos, na água, etc.
Em consequência, a atividade laboratorial na maioria dos casos, exige técnicas adequadas de esterilização. A contaminação consome tempo e dinheiro, além de alterar os resultados.
As condições de assepsia são obtidas através da adoção de procedimentos que evitam a contaminação de objetos esterilizados e de culturas puras, destruíndo-se os microrganismos com o uso de desinfestantes e de outras técnicas disponíveis.
A esterilização tem por fim eliminar, destruindo ou não, todos os microrganimos vivos de um dado recipiente ou objetos, dos meios líquidos ou sólidos, etc. Esterilizar, no conceito microbiológico, tanto é, pois, matar germes, tornando o material asséptico, como retirá-los vivos, por filtração, privando o meio de sua presença.
2. CONCEITO
Esterilização é o processo de destruição de todas as formas de vida microscópicas. Um objeto estéril, no sentido microbiológico está completamente livre de germes vivos. Os têrmos estéril, esterilizar e esterilização, por isso, referem-se á ausência total ou a destruição de todos os microrganismos.
Os métodos, aqui descritos, são os mais usados no laboratório de Fitopatologia da FAEM.
3. MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
A esterilização pode ser obtida por meios físicos, químicos ou mecânicos (esse modo só excepcionalmente tem sido empregado). O uso adequado desses tratamentos deve destruir todos os microrganismos. A seleção é determinada pelo seu custo, por sua eficiência e por sua aplicabilidade. Desaconselha-se adoção de um método apenas pela conveniência, ou o emprêgo de tempo num processo de esterilização desnecessáriamente esmerado. 
3.1. ESTERILIZAÇÃO POR MEIOS FÍSICOS
É comumente efetuada que pelo calor (seco ou úmido) quer por filtração.
3.1.1. ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR SECO 
Método mais usado para a esterilização de aparelhos e materiais resistentes ao calor seco, como placas de Petri, frascos, tubos, erlenmaiers, balões de vidro, pipetas e sólidos secos que não se fundem ou não se queimam fácilmente. Mata os organismos por oxidação, ocorrendo um processo de desidratação de seu núcleo celular. Pode ser feita:
a) FLAMBAGEM - Consiste na esterilização a chama direta: útil para a esterilização rápida de vidraria pequena ou de instrumentos de metal (pipetas, lâminas, lâminulas, alça de platina, agulhas, bisturís, estiletes, etc.)
Faz-se a flambagem (fig.2.) molhando em álcool o material a esterilizar e, em seguida passando-o sobre chama de uma lamparina ou de um bico de gás (Fig.1.). A temperatura ideal e de 45° C, no entanto, na prática, ao se flambar metal, considera-se que essa temperatura é atingida no momento em que ficar avermelhada. 
Desengorduram-se prontamente, flambando, as lâminas necessárias para a boa aderência dos líquidos usados para a montagem de cortes histológicos.
A passagem, mais ou menos rápida, da boca dos tubos de ensaio na chama após a retirada do tampão de algodão é processo obrigatório nas manipulações das culturas de microrganimos.
 
 FIG.1. Bico de gás, lamparina FIG.2. Flambagem
b) FORNO DE PASTEUR - Recipiente retangular de paredes duplas isoladas térmicamente e aquecido a eletricidade. No interior do forno há prateleiras móveis e, na parte superior, orifícios para ventilação e colocação de termômetro (Fig.3.).
 
 FIG. 3. Forno de Pasteur
Recipientes como erlenmaiers, balões de vidro, e outros que possam ser fechados com tampão de algodão, depois de tampados, são colocados no forno sem outro preparo. As placas de Petri são embrulhadas em papel antes de arrumadas no forno. As pipetas recebem pequeno tampão de algodão na extremidade pela qual vai se fazer a aspiração. Este tampão deve ser colocado de jeito que fique completamente para dentro da extremidade mencionada da pipeta (cerca de 1 cm) para não dificultar as manobras que acompanham as pipetagens. Após este preparo as pipetas são embrulhadas individualmente em papel. Todo o material deve estar rigorosamente limpo e seco antes de submetido á esterilização.
A esterilização deve prolongar-se (depois de atingida a temperatura de 300(C) durante 3 horas ou até quando os tampões de algodão ou o papel que envolve as placas mostrarem-se ligeiramente escurecidos, o que é uma indicação prática do término da esterilização. Completado o tempo necessário para a esterilização, a temperatura do forno deverá baixar lentamente, a fim de evitar o fendilhamento do material de vidro, em conseqüência da contração desigual do vidro, que se dá quando a temperatura cai bruscamente.
3.1.2. ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO
Método usado para a esterilização de líquidos e substâncias sólidas que se evaporam ou secam facilmente. A temperatura e o tempo de esterilização são menores que o da esterilização a seco, uma vez que seu poder de penetração é maior, levando os microrganismos á morte pela coagulação de proteínas.
Para esterilização de solo usa-se a esterilização fracionada que consiste em duas ou três autoclavagens
 sucessivas. Após a ultima, o mesmo, deve ser mantido em repouso durante 5 a 7 dias, para que os componentes tóxicos, como manganês, liberados durante o processo de autoclavagem sejam novamente incorporados à solução do solo, de modo a não desencadear fitotoxicidade.
AUTOCLAVE - Há vários modelos de autoclaves: horizontais, verticais (Fig 4), a gás, a vapor ou a eletricidade.
 FIG.4. Autoclave horizontal elétrica
A descrita a seguir é a do departamento de Fitossanidade da FAEM - Consiste essencialmente de uma caldeira retangular de paredes resistentes, fechada frontalmente por uma tampa que veda perfeitamente graças a interposição de uma guarnição de borracha e a parafusos que se apertam. No interior da caldeira existe uma prateleira sobre a qual se coloca o material a esterilizar Figs. 4 e 5).
 
 FIG.4. Autoclave horizontal elétrica fechada FIG.5. Autoclave horizontal elétrica aberta 
Para a esterilização opera-se da seguinte forma: Colocar água no autoclave até o nível da coluna; arrumar o material a esterilizar; fechar a tampa e ligar o aparelho, deixando a válvula aberta até a saída do vapor em jato contínuo. Com isso ter-se-á o ar do interior da câmara substituído por vapor d’agua que é muito mais eficiente na transmissão do calor. Então fechar a válvula e manter a temperatura de 120(C durante 20 minutos.
As autoclaves elétricas possuem dispositivos auto-reguladores de temperatura e pressão. 
 Desligar o autoclave, e deixar a pressão baixar lentamente (deixando escapar rápidamente o vapor do autoclave contendo tubos ou frascos com meio de cultura, estes poderão entrar em ebulição e derramar seus conteúdos). Abrir o autoclave e retirar o material esterilizado. 
3.1.3. ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO
Soluções que contenham substâncias químicas fácilmente destrutíveis pelo calor, tais como: enzimas, soros animais, algumas vitaminas, proteínas, antibióticos e certos açúcares não podem ser autoclavados. O que se utiliza, nesses casos, é a esterilização por filtração.
A filtração consiste em fazer passar substâncias líquidas ou liquefeitas através de filtros especiais esterilizados, com o fim de livrá-las de microrganismos que as contaminam. Sirva de exemplo da filtração de gases o uso de tampões de algodão para obstruir as bocas dos tubos e balões contendo meios de cultura. O algodão é suficientemente poroso para permitir a entrada do ar, porem, impede a penetração de microrganismos.
A filtração é feita em dispositivos adequados, através de velas ou discos esterilizantes.
As velas mais usadas são as de Chamberland, de porcelana e a de Berkefeld, feitas com terra de diatomáceas misturadas a asbestos e matéria orgânica.Além das velas, usam-se discos filtrantes de amianto (discos Seitz) ou de celulose modificada (mais usados devido praticidade e de seu baixo custo) filtros millipore (fig. 6), de porosidade variável.
 FIG.6. Tipos de filtros millipore
Numerosos são os dispositivos práticos usados na técnica de filtração, o de uso mais comum consiste em adaptar o suporte do filtro a um frasco chamado de Kitasato (Fig.7.), e o conjunto todo esterilizado pelo calor. 
 FIG. 7. Suporte de filtro adaptado a um Kitasato 
A solução a ser esterilizada é, então, despejada no filtro e aspirada por sucção (Fig. 8). Como o diâmetro dos poros desses filtros é necessáriamente diminuto, o uso de sucção é essencial para uma filtração razoávelmente rápida.
 
 FIG. 8. Processo de filtração por sucção a vácuo
Uma vez completada a filtração, a solução filtrada é transferida para um frasco ou tubo de ensaio préviamente esterilizado e munido de tampão de algodão. 
O tempo de duração da filtração não deve ser longo (1/2 a 1 hora no máximo).
Quando a solução a ser filtrada, for de pequena quantidade, pode-se usar uma seringa de injeção adaptada a suporte de filtros descartáveis (Fig. 9).
 FIG.9. Suporte de filtros 
 descartáveis
3.2. ESTERILIZAÇÃO POR MEIOS QUÍMICOS
Dentre as numerosas substâncias químicas que exercem ação desinfetante ou asséptica, destacamos:
- Álcool comum.
- Hipoclorito de sódio: usado na proporção de 1:1.
- Formol: usado em solução a 5%.
ESTERILIZAÇÃO
DEFINIÇÃO: É o processo de destruição de todas as formas de vida microscópicas. 
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO: A Esterilização pode ser obitida por: - MEIOS FÍSICOS ou MEIOS QUÍMICOS
Os métodos aqui descritos - > usados no laboratório de fitopatologia.
MEIOS FÍSICOS: - CALOR (ÚMIDO E SECO) ou FILTRAÇÃO
ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR SECO
- Usado para esterilizar vidrarias.
a) FLAMBAGEM: Transparência
- Usado para vidraria pequena ou instrumentos de metal
- Consiste na esterilização a chama direta - lamparina ou bico de
 Bunsen
- Tirar gordura de lâminas.
b) FORNO DE PASTEUR: Transparência
- Recipiente retangular
- Paredes duplas
- Aquecido a eletricidade
- No interior prateleiras móveis
- Na parte de cima 2 orifícios: Para ventilação e termômetro
- Uso para vidrarias - Placas de Petri
- Material limpo e seco
- Esterilização deve prolongar-se por 3 horas - Após atingor 300(C
- Esperar temperatura baixar. 
ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO
- Usado para esterilização de líquidos.
AUTOCLAVE: Vários tipos - horizontal, vertical, a gás, eletricidade. Transparência
- USO: Transparência 
ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO 
- Soluções que contenham substâncias químicas fácilmente destruidas pelo calor .
FILTRAÇÃO: Passar substâncias líquidas por filtros especiais
 esterilizados.
 Pode ser acelerado por pressão.
 
 USA-SE: - Velas (Chamberland e Berkfeld)
 - Discos filtrantes
 - Amianto - > Disco de Seitz
 - Celulose modificada - > Millipore - Transparência
MEIOS QUÍMICOS:
- Álcool comum
- Hipoclorito de sódio - > 1:1
- Formol - > solução 5% 
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