36 - Isolamento de Bacterias

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ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS
Na grande maioria das vezes, para que se possa identificar com segurança o agente etiológico de uma doença, faz-se necessário dispor desse organismo, sob forma de cultura pura em meio artificial. Uma vez dispondo da cultura pura, estudos serão feitos sobre sua patogenicidade, anatomia, fisiologia, ecologia, etc., facilitando sua identificação e caracterização. O isolamento de bactérias fitopatogênicas demanda especiais cuidados de assepsia, pois o número de operações envolvidas é grande e bactérias saprófitas acham-se quase sempre presentes associada ao tecido doente, principalmente nas lesões mais velhas.
PROCEDIMENTO
O material deve ser coletado (órgão vegetal ou planta inteira) nos estágios iniciais da infecção. Lesões velhas devem ser evitadas, pois nelas abundam fungos e bactérias saprófitas que mascaram e comprometem o sucesso do isolamento. O transporte de material do campo para o laboratório deve ser rápido e em recipientes de papel. O uso de sacos plásticos proporciona um ambiente super-úmido, altamente favorável ao desenvolvimento de organismos saprófitas.
BDA, o meio universalmente utilizado em fitopatologia, presta-se bem a esta finalidade, embora outros meios, mais ricos e mais completos ofereçam melhores condições para bom desenvolvimento da bactéria isolada.
O meio que têm-se mostrado bom para crescimento da maioria das bactérias fitopatogênicas, é o meio 523 de Kado e Heskett cuja composição é a seguinte:
	Sacarose
	10,0 g
	Caseína ácida hidrolisada
	8,0 g
	Extrato de levedura
	4,0 g
	K2HPO4 (anidro)
	2,0 g
	MgSO4.7H2O
	0,3 g
	Agar
	5,0 g
	Água destilada
	1000 ml
ISOLAMENTO DE FOLHAS
 Esquema para o isolamento de bactérias em folhas
 
- Escolha lesões típicas e recentes. Destaque pequenos fragmentos do tecido lesionado (zona de transição), com o auxílio de uma tesoura, gillette ou bisturí. Coloque esses fragmentos dentro de um recipiente contendo etanol (50%) durante 30 segundos, a fim de evitar a formação de bolhas de ar em sua superfície quando tratadas pelo desinfetante; 
- Com o auxílio de uma pinça, passe-os a solução desinfetante (NaClO - 2%) durante 3 minutos, o tempo de desinfestação varia de acôrdo com a consistência e espessura do material. O volume de desinfetante deve ser pelo menos cinco vezes maior que o material a desinfestar; 
- Decorrido o tempo para esterilização superficial dos tecidos, transfira os fragmentos (pinça flambada) para água destilada estéril (retirar o excesso de desinfetante), pelo menos 3 vezes (recipientes diferentes), após retire-os colocando os mesmos em placa de Petri (esterilizada) vazia; 
- Pegue lamina escavada e coloque uma gota de solução salina na cova. Retire um ou mais fragmentos da placa e coloque-os sôbre a cova, com o auxílio de uma pinça e bisturi corte os fragmentos em pedaços menores;
- Com um bastão de vidro, macere esses fragmentos que estão na lamina até formar uma suspensão bacteriana;
- Após a maceração, com bastão de vidro, transfira uma gota da suspensão para placa(s) de Petri com meio de cultura apropriado, pelo método de estrias ou risca;
- Etiquete a(s) placa(s), inverta-a(s) e incube-a(s) a 25 - 27SYMBOL 176 \f "Symbol"C;
- 24 a 48 horas após o semeio, repique colônias bem isoladas, para tubos de cultura. As colônias que surgem com 24 horas ou menos são geralmente, de bactérias saprófitas.
 
ISOLAMENTO DE SEMENTES
- Colocar 100 sementes dentro de um recipiente contendo etanol 96% durante 30 minutos, após esse período, retirar as sementes e, colocá-las dentro de um bequer contendo o desinfetante (hipoclorito de sódio - 2%) por 10 minutos. Enxaguar as sementes pelo menos 3 vezes em água estéril;
- Dividir as sementes em grupos de 25 e colocá-las em 4 placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa 0,75 ml de solução salina;
- Incubar a 25 - 27SYMBOL 176 \f "Symbol"C durante 24 - 48 horas, para extrair as bactérias das sementes;
- Após este período, com o auxílio de um bastão de vidro, transfira uma gota, de cada placa, da suspensão bacteriana formada, para placas de Petri, contendo meio apropriado, pelo método de estrias;
- Etiquete as placas, inverta-as e incube-as a 25 - 27SYMBOL 176 \f "Symbol"C;
- 24 - 48 horas após o semeio, repique colônias bem isoladas para os tubos de cultura.
ISOLAMENTO DE SOLO
- Preparar 10 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de solução salina;
- Pesar 1 grama de solo, peineirado, e colocar em um recipiente contendo 100 ml de solução salina. Agitar para perfeita homogeinização durante 5 minutos;
- Com uma pipeta esterilizada, transfira 1 ml desse recipiente para um dos tubos com 9 ml de solução salina. Agitar durante 1 minuto, desse último transferir, com pipeta esterilizada, para outro com 9 ml e assim sucessivamente até a diluição desejada;
- Após, transfira uma gota do tubo para placa(s) de Petri, contendo meio apropriado, pelo método de estrias;
- Etiquete a(s) placa(s), inverta-a(s) e incube-a(s) a 25 - 27SYMBOL 176 \f "Symbol"C;
- 24 a 48 horas após o semeio, repique colônias bem isoladas para os tubos de cultura.
OBS: Essa técnica têm o inconveniente de se formarem numerosas colônias de fungos e bactérias que vivem no solo e, na grande maioria não fitoparasitas. Por isso, para o isolamento de fitopatógenos que, vivendo no solo, infectam as plantas hospedeiras quando ainda na fase de muda, penetrando-
as através de suas partes hipógeas, poder-se-á empregar a técnica seguinte: semear em terra infectada, sementes sadias e desinfestadas, e aguardar o aparecimento de sintomas nas mudinhas e, isolar delas o patógeno.
ISOLAMENTO DE FEIXES VASCULARES
- Para este tipo de isolamento o método é o mesmo descrito para folhas. Porém, os fragmentos de tecidos infectados do caule devem ser de 3 a 4 cm.
ISOLAMENTO DE TUMORES
As bactérias indutoras de galhas podem ser fácilmente isoladas de lesões novas, ou provenientes de caules tenros, através do método descrito para folhas. Entretanto, o mesmo não ocorre quando os isolamentos são feitos apartir de galhas duras, ou, desenvolvidas em caules lenhosos. Para tal corta-se a galha em V e, inocula-se em plantas tenras, apartir dessa então executa-se o isolamento.
Método do semeio de bactérias em listra ou risca