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Curso de Inseminação Artificial em Éguas e Coleta REALIZAÇÃO: Coordenadores: Gilberto Guimarães Lourenço Médico Veterinário-Mestrando em Reprodução Animal-UFV Responsável técnico pelo Haras LaGlória Rafael Guedes Goretti Médico Veterinário-Mestre em Reprodução Animal-UFV Responsável técnico pelo Haras Três Corações e outros Renan Reis de Oliveira Médico Veterinário – Mestrado em Reprodução Animal – UFV Doutorando em Reprodução Animal - UFV Parceiros: VIÇOSA-MG Edição 1 Apresentação: A inseminação artificial (IA) é a principal biotécnologia aplicada ao melhoramento animal. Esta biotécnica permite que garanhões superiores tenham sua utilização maximizada durante as estação de monta e, com isso, produzam um número maior de descendentes durante sua vida reprodutiva. Conhecer não só os diferentes métodos de inseminação, mas a aplicação destes métodos na rotina de reprodução eqüina é indispensável para profissionais que almejam bons resultados no campo. Outra etapa importante para obtenção de bons resultados na IA são a coleta e manipulação do sêmen. Conhecimentos sobre os métodos de coleta, meios diluidores, tipos de equipamentos para coleta podem facilitar e incrementar os resultados na rotina de reprodução eqüina. Este curso tem por objetivo transmitir aos alunos importantes conhecimentos básicos e aplicados à reprodução de equinos, manejo reprodutivo e as artimanhas do dia-a-dia do profissional de campo. Ao final do curso, espera-se que o aluno esteja apto a executar os diferentes métodos de coleta de sêmen e inseminação artificial, conhecendo os principais limitantes a obtenção de um bom resultado prático. Gilberto Guimarães Lourenço Rafael Guedes Goretti Renan Reis de Oliveira SUMÁRIO 1 – Anatomia e Fisiologia Reprodutiva dos Equinos......................................... 1 1.1- Anatomo-Fisiologia do Garanhão............................................................. 1 1.2 – Anatomo-Fisiologia da Égua................................................................... 4 1.3- Espermatogênese e Maturação Espermática........................................... 6 1.4- Ciclo do Epitélio Seminífero...................................................................... 8 1.5- Membrana Plasmática dos Espermatozóides........................................... 9 1.6- Componentes Protéicos do Ejaculado...................................................... 9 2 – Métodos de Coleta de Sêmen em Equinos................................................ 11 2.1- Principais Métodos para Coleta de Sêmen............................................. 12 2.2 Etapas da Coleta de Sêmen com Vagina Artificial................................... 15 2.3- Área de Coleta de Sêmen....................................................................... 19 2.4- Alternativas a Utilização de Égua em Cio para Coleta............................ 19 3- Métodos de Inseminação Artificial em Éguas e sua Utilização Prática.............................................................................................................. 21 3.1- Apêndices.................................................................................................29 4 – Referências Bibliográficas......................................................................... 31 1 1- ANATOMIA E FISIOLOGIA DO TRATO REPRODUTIVO DOS EQUINOS O sucesso do programa de IA e de coleta de sêmen está diretamente relacionado ao conhecimento da sua anatomia do trato genital feminino e masculino e da fisiologia reprodutiva que o profissional Médico Veterinário possui, correlacionando informações de maneira a promover o encontro do espermatozóide e o ovócito, e viabilizando seu desenvolvimento. Assim evitam-se perdas de produtividade que é fundamental para todo sistema de produção. 1.1- ANATOMO-FISIOLOGIA DO GARANHÃO 1.1.1- Escroto Aloja os testículos, os protege e é importante na termorregulação juntamente com o músculo cremáster e o plexo pampiniforme. Comunica-se com a cavidade abdominal através dos anéis inguinais externo e interno. 1.1.2- Testículos No animal adulto, estão localizados no escroto, na posição horizontal, na região inguinal, com formato oval e medindo de 8 a 12 cm de largura. 2 1.1.3- Ducto deferente É um tubo muscular que propele os espermatozóides para o ducto ejaculatório na uretra prostática, no momento da ejaculação. 1.1.4- Epidídimo O epidídimo é um órgão alongado, localizado na superfície do testículo. Ele é monotubular, enrolado em espiral, que transporta os espermatozóides dos vasos eferentes para os vasos deferentes. O epidídimo, anatomicamente pode ser dividido em três segmentos: iniciando com a cabeça, onde o espermatozóide adquire motilidade progressiva; corpo que o habilita a fecundar; e segmento final, a cauda, local de armazenamento. 1.1.5- Ampola do ducto deferente É volumosa, contrátil e participa da ejaculação, e é uma dilatação do conduto deferente. 1.1.6- Próstata É uma glândula ímpar que circunda a uretra pélvica. É discreta no cavalo, em forma de noz. Responsável por secreção opaca, odorífera e alcalina por ocasião da ejaculação. 3 1.1.7- Vesículas seminais São glândulas pares que desembocam na uretra pélvica através de diversos ductos ejaculatórios. 1.1.8- Bulbo uretral São glândulas pares que emitem por ocasião da ereção aproximadamente 10 mL de uma secreção viscosa com a função de “limpar” a uretra e neutralizar o PH. 4 1.1.9- Pênis: É do tipo bulbo esponjoso, está alojado na bainha prepucial, é comprido e muito erétil e sua uretra faz protrusão de alguns centímetros desde a superfície da glande. 1.2- ANATOMO-FISIOLOGIA DO APARELHO GENITAL DA ÉGUA 1.2.1- Ovários Diferentemente de outras espécies, a égua possui as camadas cortical e medular invertidas, formando a fossa de ovulação, por onde será liberado o líquido folicular e o ovócito. Tem em sua estrutura um epitélio germinativo, córtex, folículos, corpos lúteos, corpos albicans, medula, área de irrigação e inervação. Sua função é gametogênica e endócrina hormonal (estrógenos, progesterona, andrógenos, inibina, activina). 1.2.2- Tubas uterinas Tem como grande função transporte, nutrição e proteção, tanto dos espermatozóides até o momento da fecundação como do embrião em desenvolvimento inicial até 5,5 dias de vida. Sua estrutura é composta por: - Fímbrias - são projeções digitiformes moveis que tem a função de captar o oócito. - Infundíbulo - sua função é captar e transportar o oócito. - Ampola - local onde vai acontecer a fecundação. 5 - Istmo - Região de transição entre o útero e as tubas uterinas vai acontecer à seleção e o armazenamento dos espermatozóides. 1.2.3- Útero Ele é formado por três regiões onde o endométrio é a mais externa, é o local onde vai acontecer a gestação. Ele alberga o concepto, também tem função de proteção, nutrição, transporte e seleção espermática. Nele é formada a placenta e também onde ocorre o controle do ciclo estral, e a mecânica do parto. 1.2.4- Cérvix Também chamada de colo uterino ela é um esfíncter natural que vai se abrir durante o estro e o parto. Tem função de nutrir, selecionar, transportar os espermatozóides, mas sua principal função é proteção. 1.2.5- Vagina É um órgão tubular copulador da fêmea,ela produz anti-corpos e o Ph vaginal tem ação de proteção. 1.2.6- Vestíbulo e clitóris No vestíbulo encontra-se a fossa do clitóris e a uretra. O clitóris está constituído de dois corpos cavernosos curtos e delgados, uma glande e um músculo ísquio-cavernoso. 1.2.7- Vulva A grande função da vulva é o direcionamento do pênis, é rica em glândulas de feromônio. É limitada por dois lábios verticais e possui o orifício. 6 1.3- ESPERMATOGÊNESE E MATURAÇÃO ESPERMÁTICA A espermatogênese nos mamíferos é um processo cíclico de multiplicação e diferenciação celular em que as células primordiais ou espermatogônias passam por complexas transformações a nível celular e molecular até a formação de espermatozóides maduros. A formação das células espermáticas ocorre nos túbulos seminíferos (epitélio seminífero) envolvidos pelas células de Sertoli. A espermatogênese pode ser dividida em três fases: - a fase proliferativa em que a célula primária diplóide, a espermatogônia, passa por repetidas divisões mitóticas para dar origem ao espermatócito; - a fase meiótica em que o material genético do espermatócito recombina e segrega para formar a célula haplóide redonda ou espermátide; - a fase espermiogênica em que a espermátide sofre a diferenciação que dará origem a espermátides alongadas, de núcleo condensado e flagelo espécie- específico, ou espermatozóides. Para que esta última fase ocorra, as espermátides sofrem uma série de transformações que incluem a formação do complexo de Golgi, da cabeça, do Corpo Uterino Corno Uterino Vagina Vestíbulo Cérvix Fórnix Vaginal Vulva Bexiga Ovário Ligamentos Tuba Uterina 7 acrossoma e a maturação. Esta etapa em que as espermátides arredondadas diplóides se transformam em espermátides alongadas maduras é conhecida como espermiogênese, constando de 14 fases até a formação definitiva do espermatozóide que será liberado para o epidídimo. A espermiogênese é a diferenciação morfológica das espermátides em espermatozóides. Estas espermátides contêm uma cabeça aerodinâmica com enzimas penetrativas e um núcleo condensado que carrega o genoma masculino e uma cauda responsável pela motilidade. O acrossoma se constitui, tanto na membrana interna como externa, num carreador de proteínas, adquiridas na sua formação e, após, na maturação, imprescindíveis para a interação do espermatozóide e zona pelúcida, reação acrossômica, fusão e penetração no oócito. Portanto, a integridade do acrossoma no processo de fecundação é fundamental para ocorrer à fusão espermatozóide-oócito. No final da espermiogênese as células espermáticas já possuidoras de flagelo, porém ainda imóveis e inférteis, são liberadas para o lúmen dos túbulos seminíferos pela ação das células de Sertoli. A movimentação destas células é proporcionada pelos fluidos secretados pelas células de Sertoli e pelo movimento contrátil exercido pelas substâncias contidas na cápsula testicular e na camada muscular dos túbulos seminíferos. Os túbulos seminíferos são conectados à cabeça do epidídimo pela “rete testis”, formada por pequenos dutos eferentes dentro dos quais ocorre a absorção dos fluídos oriundos da “rete testis” e o aparecimento de secreções necessárias ao estabelecimento da motilidade espermática. Portanto, para 8 alcançarem a cabeça do epidídimo os espermatozóides transitam pelos dutos eferentes, movimento este realizado com o auxílio das células epiteliais ciliadas e pela contração da musculatura lisa das paredes dos próprios dutos. As células epididimais são especializadas não só em criar o ambiente para amadurecer o espermatozóide, mas também para realizar a proteção imunológica. Sua funções variam, sendo a reabsorção dos fluídos dos túbulos seminíferos, promovendo a concentração do sêmen, transporte dos espermatozóides, eliminação dos espermatozóides defeituosos, maturação e armazenamento dos espermatozóides. Esta funcionalidade é baseada na manutenção do metabolismo com baixa atividade. O volume da cauda do epidídimo reflete a capacidade de armazenamento de espermatozóides do macho. Em touros e garanhões o número de espermatozóides armazenados na cauda do epidídimo pode ser suficiente para até 10 ejaculados sucessivos. 1.4- CICLO DO EPITÉLIO SEMINÍFERO O período de tempo para uma espermatogônia ser convertida em um espermatozóide incorporado dentro do lúmen do túbulo seminífero é de 55-57 dias no garanhão. Esse processo de liberação das espermátides no lúmen do túbulo seminífero é chamado de espermiação. Aproximadamente nove dias são necessários para o transporte dos espermatozóides através do sistema de ductos, conseqüentemente, uma nova população de espermatozóides pode ser ejaculada após 64-66 dias. Um ejaculado é, conseqüentemente, um composto dos eventos que ocorreram nos dois meses anteriores que influenciaram a espermatogênese quando os espermatozóides estavam sendo formados, e subseqüentemente o seu transporte e maturação através do sistema de ductos. Bilhões de espermatozóides são produzidos a cada dia (16 milhões de espermatozóides por grama de tecido testicular por dia no garanhão). Muitas das células produzidas são defeituosas e são eliminadas através de apoptose e fagocitose pelas células de Sertoli, e outras são eliminadas no ejaculado. 9 1.5- MEMBRANA PLASMÁTICA DOS ESPERMATOZÓIDES A membrana plasmática dos espermatozóides é composta de aproximadamente 70% de fosfolipídeos, 25% de lipídeos e 5% de glicolipídeos. Uma grande variação na concentração de lipídios pode ser observada quando comparamos diferentes espécies, sendo que o fator que mais varia é a quantidade de colesterol. Quando comparado com a espécie bovina, a membrana plasmática dos espermatozóides equinos possui quantidade alta de colesterol, próxima a 37%. 1.6- COMPONENTES PROTÉICOS DO EJACULADO O plasma seminal serve como meio de transporte, estimula o metabolismo das células espermáticas e as supre dos nutrientes necessários a sua passagem pelo trato genital feminino. Este é importante também, para manter a capacidade do espermatozóide se movimentar e habilidade de alcançar, reconhecer e se ligar ao oócito. Ao saírem do epidídimo os espermatozóides percorrem o vaso deferente em direção a uretra. Da passagem pelo epidídimo até a ejaculação, os espermatozóides recebem as secreções das glândulas anexas, que formam o plasma seminal, constituído de aminoácidos, peptídeos, compostos iônicos e proteína . As secreções das glândulas anexas estão controladas por hormônios andrógenos e, na maioria das espécies, são constituídas de açúcares (frutose), proteínas, ácido cítrico, prostaglandina, fosfatases, minerais, ATP e amino ácidos livres. Considerando o número de proteínas contidas no ejaculado e mesmo no trato genital feminino, torna-se impossível enumerar todas que participam do mecanismo da fertilização. O plasma seminal pode não conter fatores essenciais para a fertilização, mas as secreções otimizam as condições para a motilidade, sobrevivência e transporte dos espermatozóides tanto no trato reprodutivo masculino, como no feminino. Foi demonstrado que o plasma seminal reduz significativamente a ligação entre espermatozóides e polimorfonucleados quando espermatozóides são incubados (in vitro) em secreções de útero inflamado. Polimorfonucleados 10 encontrados em secreções uterinas afetam negativamente a motilidade de células espermáticas e atribuíram esse efeito negativo à ligação entre polimorfonucleadose espermatozóides, que forma agregados celulares. A adição de proteínas do plasma seminal autólogo, com massa molecular superior a 10 kDa ao diluente de congelamento melhora as características espermáticas pós-descongelamento, enquanto as proteínas com massa inferior a 10 kDa afetam negativamente a viabilidade espermática. O plasma seminal possui proteínas com várias funções nos espermatozóides, entre elas, o remodelamento da superfície espermática, o estabelecimento de reservas de espermatozóides na tuba uterina, a modulação da capacitação, a interação entre gametas, a modulação da resposta inflamatória e a proteção dos espermatozóides no útero. 11 2- MÉTODOS DE COLETA DE SÊMEN EM EQUINOS Os benefícios obtidos no melhoramento genético das mais diversas espécies com o uso da inseminação artificial (IA) são indiscutíveis. No entanto, para utilização da IA em larga escala é indispensável a coleta do sêmen em quantidade e qualidade suficientes. Além disso, a coleta de sêmen permite avaliar o potencial reprodutivo de garanhões, evitando prejuízos caso os animais possuam potencial reprodutivo reduzido. As primeiras coletas de sêmen em equinos foram realizadas de formas bastante rústicas. Após o garanhão cobrir éguas parte do sêmen ficava retido na vagina, onde com auxílio de espátulas, colheres ou até mesmo seringas, este sêmen era coletado. Outro método foi o uso de esponjas vaginais que absorviam parte do sêmen ejaculado. Apesar do sucesso na obtenção de espermatozóides por estes métodos, o volume coletado era pequeno e a qualidade seminal mais baixa devido, principalmente, a alta contaminação. Dados os riscos de contaminação e as perdas da maior parte do ejaculado, novos métodos de coleta foram desenvolvidos. Um destes envolveu procedimento cirúrgico, onde o ejaculado era coletado por meio de uma fístula uretral. Apesar de possibilitar uma coleta de qualidade, este método teve maior aplicação em experimentos, uma vez que impossibilitava o garanhão de servir éguas por monta natural. Outras alternativas, como, o uso de bolsas de borracha posicionadas na vagina de éguas em cio, ou, até mesmo bolsas de látex (Camisa-de-Vênus, camisinha, Condom) que envolviam o pênis de garanhões foram utilizadas. Estes métodos foram populares em vários países até a década de 60, no entanto, devido a maior contaminação, a perda de alguns ejaculados no qual a bolsa se deslocava e a menor praticidade, estes métodos cederam lugar à vagina artificial, hoje amplamente utilizada (MOREL, 1999). Muito se questiona sobre o uso da eletroejaculação para garanhões devido ao amplo uso em algumas espécies, como, bovinos e caprinos. No entanto, a possibilidade de traumas aos operadores e animais devido ao temperamento dos garanhões tem desencorajado seu uso. Relatos na literatura 12 de falhas na coleta de sêmen por eletroejaculação em animais anestesiados, têm limitado seu uso inclusive em pacientes terminais (CARY et al., 2004). Apesar dos diversos métodos de coleta desenvolvidos, na atualidade, são utilizados basicamente quatro: Camisa-de-Vênus (camisinha, condom), fármacos indutores da ejaculação, estímulo manual do pênis e vagina artificial. Em situações específicas pode ser necessário utilizar outro método, mas, na rotina de coleta de sêmen o método de vagina artificial é o mais utilizado (SAMPER, 2009). 2.1- Principais métodos para coleta de sêmen: 2.1.1- Coleta por “Camisa-de-Vênus”: é considerada uma alternativa pior que a vagina artificial, mas pode ser uma alternativa para aqueles animais que não se adaptem a este método de coleta, ou, nos casos em que a VA não esteja disponível. O animal é estimulado com uma égua em cio, após a exposição do pênis a “Camisa de Vênus” (FIGURA 1) é colocada no pênis do animal. Após a cobertura da égua e ejaculação, o aparato é removido e o sêmen é filtrado para remoção do gel e debris. A qualidade seminal por este método é inferior ao obtido por vagina artificial principalmente devido a maior contaminação. Figura 1: Camisa-de-Vênus. 2.1.2- Coleta por meio de fármacos indutores da ejaculação: tem sido recomendado para pacientes com disfunções ejaculatórias, ou, em casos de lesões músculo-esqueléticas que impeçam o garanhão de realizar a monta em éguas. Os principais medicamentos utilizados afetam as contrações da musculatura lisa genital dos garanhões. Dentre os compostos estudados incluem: xilazina, imipramina, prostaglandina F2α e a detomidina. As taxas de 13 ejaculação por este método têm variado de 27-75% das tentativas (McDonnell, 2001). Os animais são previamente estimulados com uma égua em cio. Depois são levados até as baias onde são mantidos até se acalmarem. Em uma das metodologias 3 mg/kg de cloridrato de imipramina é fornecida pela via oral ao animal. Duas horas depois são administrados 0,66 mg/kg de xilazina pela via intravenosa. Após a exposição do pênis uma sacola plástica é presa ao prepúcio do garanhão, dentro de 5-15 min. o animal tende a ejacular. Este método apresenta como vantagens propiciar um sêmen apresentando menor volume, maiores concentração e número total de espermatozóides. Fato que pode ser aproveitado em programas de criopreservação espermática por eliminar a centrifugação. Como desvantagens, estão: a variabilidade de resposta ejaculatória entre animais e os efeitos secundários das drogas utilizadas. 2.1.3- Coleta por estímulo manual do pênis: é um método pouco utilizado na rotina de centrais e fazendas especializadas. Pode ser uma opção nos casos onde a vagina artificial não esteja funcional ou disponível. Requer um maior treinamento do veterinário que está realizando a coleta, porém, não interfere nos parâmetros seminais quando comparado com a coleta com VA (Crump, 1989). Tal procedimento pode ser realizado após o animal realizar a monta no manequim, ou, com garanhão em estação. Para coleta o animal é estimulado com uma égua em cio, ou, manequim, ou, urina de égua em cio; após a ereção realiza-se a limpeza do pênis com água aquecida (45ºC), após secagem uma bolsa de plástico estéril é posicionada no pênis ao redor da glande; uma das mãos é apoiada próximo ao anel prepucial, esta mão faz movimentos rítmicos na base do pênis (nesta mão pode posicionar uma compressa úmida, com água aquecida de 45-50ºC para maior estímulo do garanhão); a outra mão envolve a glande, realizando pressão contrária, como ilustrado na figura abaixo: 14 FIGURA 2: coleta de sêmen por estímulo manual com animal em estação (CRUMP, 1989). 2.1.4- Coleta de sêmen por vagina artificial (VA): Os primeiros modelos de vagina artificial desenvolvidos para equinos foram produzidos na Rússia, na década de 1930. A partir deste modelo, na década de 40, outras VAs passaram a ser amplamente divulgadas, como o modelo um russo (Cambridge) e o modelo americano (Missouri). A vagina artificial russa (Cambridge) era constituída de um grande tubo de metal (54 cm de comprimento e 13 cm de largura), envolvido internamente por uma borracha, formando um espaço entre o tubo e a borracha que era preenchido com água. Uma camada extra de borracha era adicionada e acoplada a um copo coletor onde o sêmen era depositado. Problemas como a dificuldade de manter uma pressão adequada para coleta de sêmen e a necessidade muitas vezes de duas pessoas para sustentar o peso dos primeiros protótipos durante a coleta, levaram ao desenvolvimentode VAs com outros materiais, como, alumínio e plástico. O modelo Missouri de VA emergiu na América na mesma época que o modelo Cambridge na Rússia. No entanto, o modelo americano era um pouco mais complexo: um cilindro de borracha externo (15 cm de diâmetro e 45 cm de comprimento) era vulcanizado nas duas extremidades a um tubo de borracha que passava internamente. Na extremidade proximal existia uma constrição feita por uma faixa de borracha com intuito de simular a vagina da égua. Na extremidade distal era acoplado um copo de coleta. Algumas alterações foram feitas ao longo dos anos buscando simular de forma mais precisa a monta natural, mas as bases desenvolvidas principalmente na década de 1940 são semelhantes às dos modelos Missouri de VA utilizados atualmente. 15 Após a popularização do uso das VAs, diversos modelos foram desenvolvidos (Nishikawa, Colorado, Hanover Francesa, Roanoke, Botucatu), sendo cada vez mais leves e fáceis de manipular. A grande vantagem com o uso das VA´s foi a redução nas taxas de contaminação do sêmen, pois com a passagem direta do sêmen ao copo coletor, evitou-se o contanto deste com a parte externa do pênis e as secreções vaginais. Além disso, a rápida adaptação da grande maioria dos garanhões, as semelhanças de comportamento com a monta natural e a facilidade do manuseio tornam a coleta por VA o principal método de coleta de sêmen de garanhões. Os modelos de VA funcionam de forma similar, onde uma câmara interna pode ser preenchida com água aquecida ou ar, para proporcionar pressão e temperatura adequadas. Esta câmara, geralmente formada por uma borracha, é suportada por materiais rígidos, como: couro (Missouri), plástico (Colorado, Roanoke), alumínio (Nishikawa) e fibra de vidro (Botucatú). Além da camada de borracha, uma mucosa plástica descartável envolve o tubo rígido, eliminando a necessidade de lavar a mucosa de borracha entre as coletas. O sêmen é depositado na porção posterior da VA de onde é direcionado para o copo coletor que pode conter um filtro (reter sujeira, debris, gel) e o saco de coleta. 2.2- Etapas da coleta de sêmen com VA: Preparo do material para avaliação e manipulação do sêmen (diluidor, lâmina, lamínula, ponteiras, seringa). 16 Preparo do material para montagem da VA (VA, mucosas, filtro, saco de coleta, lubrificante, copo coletor, etc). Montagem da VA e aquecimento da água para VA (45-50ºC). Preparo da égua em cio para coleta. 17 Aproximação com calma do garanhão até a égua. Após ereção, permitir que o garanhão realize a monta na égua. Deslocar o pênis do garanhão para o interior da vagina artificial. 18 Posicionar a mão na base do pênis e observar os sinais da ejaculação. Ao iniciar a ejaculação inclinar a VA em direção ao copo coletor. Abrir a válvula após os três primeiros pulsos ejaculatórios. 19 Lavar as mãos e manipular o sêmen 2.3- Área de coleta de sêmen: Em grande parte dos haras não existe um lugar próprio para coleta de sêmen devendo o veterinário escolher um local mais adequado. Algumas características como boa drenagem; piso não escorregadio; tranqüilidade, de preferência afastado de outros garanhões e éguas; estrutura para amarrar a égua em cio e espaço dos lados caso ela se movimente durante a coleta são importantes. O fato da maior parte dos criadores não possuírem construções próprias para coleta de sêmen muitas vezes levam os veterinário a improvisar locais cobertos durante dias de chuva. É importante que estes locais atendam às características acima citadas para evitar acidentes com os animas, técnicos e equipamentos de coleta. 2.4- Alternativas a utilização de égua em cio para coleta: Em algumas propriedades no momento da coleta de sêmen pode não haver nenhuma égua em cio. Pensando nestas situações e quando se deseja congelar sêmen fora da estação de monta foram desenvolvidos métodos alternativos a utilização de éguas em cio natural para coleta de sêmen. 2.4.1- Indução química do estro: durante o período de ciclicidade, o estro pode ser induzido em éguas em diestro pela aplicação da PGF2α e seus análogos. É importante que a aplicação seja realizada após o 5º dia da ovulação. As éguas 20 tendem a manifestar o estro dentro de dois a três dias após a aplicação, podendo-se programar para coleta de sêmen. Estrógenos sintéticos podem ser utilizados para indução do estro em éguas com intuído de coletar o sêmen. Para sucesso no processo é importante que as éguas não estejam no diestro, ou seja, não possuam CL ativo. Na grande maioria das vezes tem-se dado preferência para éguas em anestro ou ovariecomizadas. A manifestação de estro inicia-se algumas horas após a aplicação. As dosagens devem seguir as recomendações dos fabricantes. 2.4.2- Uso de manequim para coleta de sêmen: as grandes vantagens do uso de manequim para coleta de sêmen são: a não necessidade de éguas em cio para coleta de sêmen e a maior estabilidade durante a coleta (as éguas podem se movimentar durante a coleta). A grande maioria dos animas se adaptam com o mínimo de treinamento a coleta em manequins, sendo mais fácil o treinamento de animais jovens, ainda não adaptados a cobrir éguas. Os manequins devem ser estáveis de forma a não permitirem movimentação durante a monta do garanhão, sendo construídos com madeira ou metal e fixos ao solo, devem ser cobertos com material não abrasivo e de fácil limpeza, como o couro natural ou sintético, devem ter regiões ao qual o garanhão possa se agarrar, da forma como faz naturalmente na crina e ílios da égua, tais como áreas mais estreitas que outras no corpo do manequim. Apesar das vantagens poucas centrais e haras possuem manequins, muito devido a pouca divulgação do seu uso no Brasil. 21 3- MÉTODOS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM ÉGUAS E SUA UTILIZAÇÃO PRÁTICA A indústria equina mundial exerce importante papel como fonte geradora de renda e empregos. Em um recente estudo estimativo sobre a indústria do cavalo no Brasil, demonstrou-se que o rebanho efetivo é de cerca de 8,5 milhões de equinos e 1,2 milhões de muares e jumentos. Esse segmento agropecuário é responsável pela geração de 600 mil empregos diretos e 3,2 milhões de empregos indiretos (CNA, 2006). A inseminação artificial é a biotécnica da reprodução mais importante e mais utilizada para o melhoramento genético das espécies, devido a poucos machos selecionados produzirem espermatozóides para a inseminação de centenas de fêmeas por ano. Em contraste, poucos produtos podem ser obtidos de cada fêmeas por ano, mesmo com o advento de novas biotécnicas como a transferência de embriões e fertilização in vitro (AX et al., 2000). A primeira referência de Inseminação Artificial (IA) em equinos supostamente apareceu em textos Arábicos, e seu uso foi reportado no século XIV. Porém não existe evidência de que esta prática foi difundida naquela época. Pesquisas científicas no uso da IA foram primeiramente descritas por um fisiologista Italiano: Spallanzani em 1700. No século XIX a inseminação artificial já era utilizada por fazendeiros Norte-Americanos (Davis Morel, 1999). O uso da inseminação artificial acelera o melhoramento genético, viabiliza a obtenção de produtos de reprodutores alojados em outros países ou até mesmo que já morreram, evita a transmissão de doenças venéreas, facilitaa realização de testes de progênie além de possibilitar que machos subférteis produzam filhos. Entretanto, para que se obtenha sucesso em programas de inseminação artificial, são necessários alguns cuidados como a utilização de machos de boa qualidade, um bom controle sanitário e mão de obra especializada (MIES FILHO, 1987). Na Europa, o primeiro nascimento por IA foi relatado em 1890 por Franceses. Ainda no século XIX o Professor Hoffman de Stuttgart na Alemanha, deu uma descrição detalhada da técnica e os instrumentos requeridos. No século XX pesquisadores demonstraram a importância da IA 22 para otimizar o uso de Garanhões de elevados valores zootécnicos e comercial (Davis Morel, 1999). Na Alemanha, dados da Central de Reprodução Equina de Celle, que é a responsável por 60% de todas as coberturas de éguas da principal raça alemã (Hanoveriana), têm demonstrado crescimento exponencial nos últimos anos, onde cerca de 90% das éguas são cobertas por IA com sêmen resfriado (AURICH; AURICH, 2006). A inseminação artificial em equinos é largamente praticada em todo o mundo, e a maneira mais comumente usada nessa espécie é mediante o resfriamento e transporte de sêmen (LOOMIS, 2006). Aparentemente, no mundo, os países que mais realizam IA com sêmen resfriado transportado são Estados Unidos, seguido pelo Brasil (PAPA et al., 2005). A primeira vagina artificial foi desenvolvida em 1930 em Moscow, década em que aproximadamente 120.000 éguas foram inseminadas artificialmente na Rússia. Vários outros países difundiram a IA no inicio do século XX, tais como: Japão, China, Estados Unidos, Brasil entre outros (Davis Morel, 1999). Outra modalidade de colheita, utilizada em casos em que o garanhão apresenta incapacidade de monta ou disfunção comportamental, utiliza a combinação de dois fármacos, iminaprina e xilazina para a obtenção do ejaculado, obtendo-se sucesso razoável de 30 a 50% (SAMPER, 2007). A maioria das associações de criadores, permitem a utilização da inseminação artificial, para aplicação de sêmen fresco e refrigerado. Entretanto, algumas destas associações não permitem a aplicação de sêmen congelado (SQUIRES et al., 1999). O uso da IA em um programa de acasalamentos permite várias vantagens em relação à monta natural. Primeiramente porque um simples ejaculado pode ser dividido em várias doses, permitindo o uso mais eficiente do sêmen do garanhão. Várias éguas podem ser inseminadas com apenas um ejaculado e também o número de éguas acasaladas com um garanhão por estação de monta pode aumentar. A adição de antibióticos nos diluentes de sêmen reduz a transmissão de várias doenças bacterianas para a égua, onde o Garanhão é o carreador. A transmissão de patógenos da égua para o garanhão também é eliminada (Davis Morel, 1999). 23 A IA pode ser realizada de diferentes formas de processamento do sêmen: in natura; diluído, diluído transportado; diluído resfriado transportado e congelado. Cada um dos tipos de tecnologia de processamento tem suas vantagens, limitações e indicações (CARVALHO, 1992). Os extensores ou diluidores de sêmen possuem substâncias capazes de melhorar a fertilidade de reprodutores sub-férteis e manter os espermatozóides vivos por mais tempo no trato reprodutivo da égua. A inseminação também pode ser utilizada naqueles casos em que o Garanhão tem dificuldade de penetração e monta por alguma patologia. Além disso, a coleta do sêmen permite uma avaliação da qualidade do mesmo antes da inseminação e detecção de patologias e problemas de infertilidade do Garanhão (Davis Morel, 1999). O manejo de sistemas de inseminações de éguas consiste na rufiação ou palpação retal para a detecção do estro. As éguas devem ser inseminadas em dias alternados a partir do terceiro dia de cio ou após a detecção de um folículo ovariano maior ou igual a 35 mm até a constatação da ovulação ou final do estro. Taxas de gestações aceitáveis são obtidas quando as inseminações são feitas em intervalos de 48 a 72 horas quando se usa garanhões com sêmen de excelente qualidade. Porém, para aqueles garanhões sub-férteis as inseminações devem ser realizadas uma ou duas vezes por dia (Davis Morel, 1999). Para inseminação com sêmen refrigerado é recomendado a inseminação em intervalos de 24 h caso não seja detectada a ovulação na égua (Davis Morel, 1999). Quanto à metodologia de IA a ser empregada, diversos fatores devem ser considerados, uma vez que podem ser muitas as variáveis envolvidas no processo como: localização da(s) propriedade(s); momento inseminante (pré e/ou pós-ovulação); número total de espermatozóides; volume; diluidor; temperatura do armazenamento; características individuais de qualidade do sêmen do garanhão; valor do sêmen; reposta inflamatória uterina da égua a ser inseminada; tipo de cio; momento da estação; raça, entre outros fatores (SQUIRES, 1999). A utilização de sêmen, fresco, diluído e resfriado, implica em maior flexibilidade de manejos de controle folicular, momento e local de deposição do 24 sêmen. Pelo contrário, sêmen congelado exige um manejo mais rígido, palpações retais mais freqüentes e, quanto ao local de deposição, preferencialmente, o mais profundo no corno uterino ipsilateral à ovulação (SAMPER; ESTRADA; MCKINNON, 2007). Hoje, com os avançados mecanismos de predição acurada da ovulação, além do uso de drogas indutoras de ovulação, diminui o número de inseminações requeridas por acasalamento, tornando mínima a utilização do garanhão. A diminuição do número de inseminações melhora a eficiência do programa de acasalamento e reduz o risco de contaminação iatrogênica do trato reprodutivo da égua (Davis Morel, 1999). A Indução farmacológica da ovulação é um procedimento fundamental na maximização e sucesso de diferentes protocolos de utilização de sêmen eqüino. Esta ferramenta tem sido amplamente utilizada nas inseminações com sêmen refrigerado, congelado e na sincronização para transferência de embriões (MELO et al., 2005). O hormônio mais comumente utilizado é o hCG (gonadotrofina coriônica humana), que provoca a ovulação em até 48 horas (MEDEIROS, 2005). O hCG é uma grande molécula glicoproteica, que quando utilizada em repetidas aplicações promove o desenvolvimento de anticorpos tornando-a ineficiente como promotora da ovulação (MELO et al., 2005). Segundo Melo et al. (2005), o GnRH sintético (Deslorelina) e o extrato de pituitária equina (EPE) estão apresentando-se como alternativas eficazes para o desencadeamento da ovulação em tempo pré-determinado sem a ocorrência da formação de anticorpos, desta forma podendo se utilizados em vários ciclos consecutivos. Tanto o GnRH sintético, quanto o EPE sincronizaram com grande eficiência o tempo de ovulação de éguas induzidas com folículos de 35mm, sendo que o EPE adianta em aproximadamente 4 horas o momento da ovulação em relação à deslorelina, sendo que o tempo médio para ovulação com a utilização de 10mg de EPE foi de 34,75 +/- 6,72 horas, enquanto que o tempo médio de 1mg de deslorelina foi de 38,49 +/- 7,38 horas (MELO et al., 2005). Segundo Medeiros et al. (2005), tanto a dose de 10mg, quanto a dose de 5mg de EPE foram eficazes em induzir a ovulação no período de 48 horas, 25 utilizando uma dose bem inferior a preconizada na literatura, tornando-se uma alternativa como agente de indução de ovulação em programas onde se requer grande precisão do momento da ovulação, como a inseminação artificial com sêmen congelado. O mesmo autor relatou que não houve diminuição da eficiência após 4 aplicações em cada animal, demonstrando que,por ser de origem homóloga, a droga não estimula a formação de anticorpos. Normalmente em um programa de IA as éguas são inseminadas com 250 a 500 milhões de espermatozóides com motilidade progressiva (viáveis). Uma dose adequada de espermatozóides requer menor número de ciclos por prenhês (Davis Morel, 1999). Sabe-se que o momento de se realizar as inseminações com sêmen refrigerado, é mais crítico do que com sêmen fresco. Os melhores resultados com sêmen refrigerado são obtidos quando as inseminações são realizadas em um intervalo de zero a 24 horas antes da ovulação, com 500 milhões a um bilhão de espermatozóides. As taxas de concepção para os garanhões que possuem boa qualidade de sêmen após 24 horas de refrigeração, é aproximadamente 10% menor do que as taxas obtidas com sêmen o fresco (SQUIRES et al., 1999). O número de espermatozóides em uma dose inseminante é mais importante que o volume propriamente dito. Pequenos volumes podem ser usados com sucesso tanto quanto 10 a 25 ml de sêmen mais diluente. Volumes menores ainda (como 0,5ml) podem ser usados quando a inseminação é feita pós-ovulação com sêmen congelado (Davis Morel, 1999). As inseminações com sêmen fresco e refrigerado, são bastante difundidas e a maioria dos criatórios de equinos utiliza destas técnicas, obtendo resultados satisfatórios. Entretanto, a utilização do sêmen congelado ainda é restrita, pois além de exigir um melhor controle do momento da ovulação, os resultados são inferiores aos obtidos com sêmen fresco e refrigerado (SQUIRES et al., 1999). É recomendada a inseminação logo após a ovulação quando se deseja utilizar sêmen congelado, devido ao baixo número de espermatozóides inseminante e a queda na qualidade do sêmen. Para isso as éguas devem ser examinadas de 4 a 6 vezes por dia para que a inseminação seja feita no 26 máximo até 6 h após a ovulação, período em que ainda não houve queda na qualidade do ovócito (Davis Morel, 1999). O local de deposição do sêmen no momento da inseminação artificial é um fator bastante estudado em todas as espécies, pois é de suma importância para obtenção de bons resultados de fertilidade. Algumas técnicas de inseminação ultrapassam etapas do transporte espermático pelo útero (GINTHER, 1992). Todas as inseminações devem ser executadas com técnica de contaminação mínima: com a égua devidamente contida, com a cauda enfaixada e elevada e a área entre a base da cauda e comissura ventral da vulva esfregada, lavada e secada. O sêmen contido em uma seringa é depositado dentro do corpo uterino por pipeta estéril de inseminação de 22 polegadas (Davis Morel, 1999). O técnico deve usar luva esterilizada de plástico, protegendo até o ombro quando tiver passando a pipeta através da cérvix para o corpo uterino, onde o sêmen será depositado. Uma pequena quantidade de lubrificante não espermicida pode ser aplicada na luva. O braço do inseminador e a pipeta são passados entre os lábios vulvares para a parte cranial da vagina, onde o operador identifica e penetra a cérvix. A pipeta de inseminação é avançada através da cérvix até o corpo uterino, onde o sêmen é lentamente depositado (Davis Morel, 1999). Com a monta natural ou inseminação artificial, os espermatozóides tem que migrarem pelo útero até o oviduto, local onde ocorre a fertilização e devido a este fato, é importante que o sêmen apresente boa motilidade, principalmente para passarem pela cérvix e junção útero-tubárica (HUNTER, 1999). Em equinos, o transporte espermático é completo quatro horas após a inseminação (BRINSKO et al., 1991). Os espermatozóides penetram na tuba uterina de porcas entre 15 e 30 minutos após a inseminação ou monta natural e após uma hora, uma quantidade de espermatozóides suficiente para fertilizar 90% dos oócitos já penetraram na tuba (HUNTER, 1984). Foi demonstrado que a habilidade dos espermatozóides, provenientes de sêmen congelado, de atingirem o oviduto, particularmente a região da ampola, é menor do que de sêmen fresco e esta dificuldade no transporte 27 espermático do sêmen congelado, pode ser devido à alterações bioquímicas e físicas na célula espermática (BARDER, 1982). Scott et al. (1995) observaram uma diferença no transporte espermático entre animais férteis e subférteis, mostrando que o transporte e sobrevivência dos espermatozóides no trato reprodutivo feminino é melhor quando se utiliza sêmen de garanhões férteis do que subférteis e quando se trabalha com éguas sem problemas reprodutivos. Ao atingirem o oviduto, os espermatozóides interagem com as células epiteliais, formando um reservatório de gametas funcionais na porção caudal do ístimo, onde os espermatozóides que se aderiram ao oviduto reduzem seu metabolismo e mantém a motilidade e capacidade fertilizante por um tempo mais prolongado (POLLARD et al., 1991). A inseminação pode ser feita no ápice do corno uterino próximo a junção útero-tubárica. Para isso é necessário o auxílio de endoscópio ou extensão de probe do ultrassom com guia de agulha que perfura o útero e deposita o sêmen na papila, ou simplesmente pode ser utilizada uma pipeta flexível, que é colocada no ápice do corno uterino, ipsilateral ao ovário que contém o folículo em desenvolvimento, com a sua manipulação pelo reto. Para isto é necessário treino e habilidade do operador. Esta técnica além de menos invasiva consegue taxas de prenhês semelhante às outras (Silva, 2004). A IA no ápice do corno uterino é especialmente recomendada quando queremos utilizar sêmen congelado ou de epidídimo que estão disponíveis em pequenos volumes e pequenas doses. A porcentagem de prenhez com a utilização do sêmen congelado é baixa e bastante variada, sendo que esta variação se deve: a diferentes protocolos de congelação; efeito do garanhão; diferença na fertilidade das éguas e diferentes protocolos de inseminação (BRISKO & VARNER, 1992). Já foi demonstrado que o sêmen congelado eqüino não tem a mesma habilidade de interagir-se com as células epiteliais do oviduto do que o sêmen fresco, mantendo assim, sua viabilidade por um menor tempo (SCOTT, 2000). Indica-se que a inseminação com sêmen congelado, seja realizada de zero a 24 horas antes da ovulação, ou até 6 horas após (SQUIRES et al., 1999). 28 Com o objetivo de melhorar os índices de fertilidade de indivíduos subférteis, maximizar o aproveitamento de animais férteis de alto potencial e conseguir melhores resultados com a aplicação do sêmen congelado, alguns autores têm estudado a possibilidade do uso da inseminação histeroscópica em equinos, na qual faz-se a deposição do sêmen sobre a junção útero- tubárica com auxílio de um endoscópio. Morris et al. (2000a) obtiveram um índice de prenhez de 60%, inseminando 15 éguas com 10x106 espermatozóides provenientes de sêmen fresco, os quais foram depositados sobre a papila tubárica com auxílio de um endoscópio. Vazquez et al. (1998), empregando técnica similar, utilizando aproximadamente 3,8 x 106 espermatozóides com motilidade progressiva, obtiveram 30% de prenhez. Papa & Dell’Aqua Júnior (2001) avaliaram o efeito do local de deposição do sêmen e a concentração da dose inseminante e obtiveram 20% de prenhez com a deposição de 50x106 espermatozóides pré ovulação no corpo do útero e nenhuma prenhez com a deposição do mesmo número de gametas na extremidade do corno. Com a deposição de 150x106 espermatozóides pré e 150x106 pós ovulação obtiveram 40% de prenhez quando o sêmen foi depositado no corpo do útero e 50% quando o sêmen foi depositado na extremidade do corno, não sendo observada diferença estatística entre os gruposcom diferentes locais de deposição do sêmen. A inseminação artificial em equinos é uma realidade praticada nos principais centros de reprodução e criação de cavalos do Brasil e do Mundo, tornando-se ferramenta importante para o uso adequado dos Garanhões em programas de reprodução assistida. 29 3.1- APÊNDICES: 30 31 4- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARRUDA, R. P.; ANDRADE, A. F. C.; et al. Biotécnicas aplicadas à avaliação do pontecial de fertilidade do sêmen eqüino. Rev Bras Reprod Anim, Belo Horizonte, v.31, n.1, p.8-16, jan./mar. 2007. AURICH J., AURICH C. Developments in european horse breeding and consequences for veterinarians in equine reproduction. Reproduction Domestic Animals, v. 41, n. 4, p. 275-279, 2006. AX, R.L., et al. Artificial insemination. In: HAFEZ, E.S.E. & HAFEZ, B. Reproduction in Farm Animals. Seventh edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Chapter 26, 376-389. BARDER, H. An investigation of sperm migration into the oviducts of the mare. J. Reprod. Fertil., v.32, p.59-64, 1982. BARRETO, M. 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A sede administrativa do portal é localizada na cidade de Viçosa-MG que é referência internacional em ensino, onde estão situadas a Universidade Federal de Viçosa – UFV, que é uma das mais conceituadas Universidades de Ciências Agrárias da América Latina e, também, a Faculdade UNIVIÇOSA, que conta com diversos cursos, inclusive o de Medicina Veterinária. Para a manutenção, o Portal Revista Veterinária conta com pessoal altamente qualificado e treinado, incluindo pesquisadores e professores médicos veterinários pertencentes ao corpo técnico do Grupo. www.revistaveterinaria.com.br 37 O Shop Veterinário é uma empresa que foi idealizada para atender com excelência o mercado na área de medicina veterinária e agropecuária em todo o Brasil e inclusive no exterior, com produtos e equipamentos renomados e de alta qualidade. A empresa reuniu os principais fabricantes, garantido ao cliente um leque de produtos de alto nível com fidelidade, informações, garantia e total suporte técnico. O Shop Veterinário pertence a um Grupo que trabalha há mais de 25 anos com difusão de tecnologia e conhecimento, sendo referência em sua área de atuação, pela liderança, agilidade e qualidade dos seus serviços prestados. Tem como meta, implementar soluções inovadoras, preocupando sempre com o pós venda, conforto e satisfação dos seus clientes, oferecendo segurança e qualidade dos produtos. A excelente política de preços adotada pelo Shop Veterinário torna possível ter diversos produtos no mercado veterinário com ótima relação custo benefício, tornando a empresa em uma posição de mercado altamente competitiva. Temos como objetivo ser umas das mais completas empresas brasileiras no ramo de comercialização de produtos e equipamentos de uso veterinário, com compromisso na entrega, qualidade e satisfação dos clientes, sem esquecer a preocupação com os animais e com o meio ambiente. Nossa missão é oferecer ao mercado os melhores produtos e equipamentos veterinários em qualidade e custo benefício. A sede da empresa é localizada na cidade de Viçosa-MG que é referência internacional em ensino, onde estão situadas a Universidade Federal de Viçosa - UFV, que é uma das mais conceituadas Universidades de Ciências Agrárias da América Latina e, também, a Faculdade UNIVIÇOSA, que conta com diversos cursos, inclusive o de Medicina Veterinária. 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O Portal Revista agropecuária pertence a um Grupo que trabalha há mais de 25 anos com difusão de tecnologia e conhecimento, sendo referência em sua área de atuação, pela liderança, agilidade e qualidade dos seus serviços prestados. A sede administrativa do portal é localizada na cidade de Viçosa-MG que é referência internacional em ensino, onde estão situadas a Universidade Federal de Viçosa – UFV, que é uma das mais conceituadas Universidades de Ciências Agrárias da América Latina e, também, a Faculdade UNIVIÇOSA, que conta com diversos cursos, inclusive o de Medicina Veterinária. 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Além da Escola do Cavalo, outros dois portais também foram idealizados com a finalidade de leva informações atualizadas e direcionadas ao público interessado. São eles a Revista Agropecuária e a Revista Veterinária. A sede administrativa do Portal é localizada na cidade de Viçosa-MG que é referência internacional em ensino, onde estão situadas a Universidade Federal de Viçosa – UFV, que é uma das mais conceituadas Universidades de Ciências Agrárias da América Latina e, também, a Faculdade UNIVIÇOSA, que conta com diversos cursos, inclusive o de Medicina Veterinária. Para a manutenção, o Portal Escola do Cavalo conta com pessoal altamente qualificado e treinado, incluindo pesquisadores e professores Médicos Veterinários pertencentes ao corpo técnico do Grupo. www.escoladocavalo.com.br 40 O Portal Suínos e Aves foi idealizado para oferecer diversas informações como dicas de saúde, manejo, tecnologia, genética, cursos, eventos, produtos entre outras informações. 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