[FR153] [CARDIO] 4 diagn lab tuberculose farma 2013

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Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose e outras micobacterioses
Prof. Carlos Emílio Levy
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Gênero Mycobacterium
Família: Mycobacteriaceae
Gênero: Mycobacterium
Definição:
Bacilos finos e retos
0,2-0,6 por 1-10m
Aeróbios estritos
Imóveis
Não esporulados
Gram positivos
Bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR)
I- Generalidades
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Gênero Mycobacterium
Complexo M. tuberculosis*
M. tuberculosis
M. bovis (e M. bovis BCG)
M. africanum
M. microti M. canetti
M. leprae
M. não tuberculosis (MNT)
Crescimento lento
Compl. M. avium
M. kansasii
 crescimento rapido
M. fortuitum
M. abscessus.
II - Classificação
*similaridade genetica 99,9%
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Aspectos Microbiológicos
 teor lipídico na parede celular 
Barreira hidrofóbica
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Transmissão 
A disseminação acontece pelo ar através de aerossóis pela tosse espirro ou fala.
O espirro de uma pessoa infectada joga no ar cerca de dois milhões de bacilos. 
Fonte : CDC
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Formas clínicas da tuberculose
TB renal
TB miliar
Mycobacterium marinum
Tuberculose pode ocorrer:
Primo-infecção (TB primária)
Ativação de foco endógeno
Re-infecção exógena
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Sintomas Clínicos
Pulmonar
 Tosse + expectoração com > 3 semanas de duração
 Escarro às vezes com sangue 
 Suores noturnos 
 Adinamia 
 Emagrecimento 
 Dores no peito ou nas costas 
Extrapulmonar
urogenital ,osteoarticular, cérebro, meninges e pele.
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M. tuberculosis- DIAGNÓSTICO LABORATORIAL 
Material clínico
Pulmonar:
Escarro espontâneo ( 2 a 3 amostras)
Escarro induzido (NaCl 3%)
Lavado bronquioalveolar
Biópsia
Extrapulmonar:
LCR
serosas
Urina
Biópsias
Gânglio
Sangue (bacteremia)
Intestinal -biópsia
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líquor
abscesso
urina
escarro
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É o exame básico para o diagnóstico da TB, especialmente para a forma pulmonar. 
Por ser rápida e de fácil execução, permite a pronta identificação dos pacientes bacilíferos.
Baciloscopia
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M. tuberculosis – processamento de amostra
Descontaminação 
Método Petroff modificado
( NAOH 4%, Tampão Fosfato e HCl )
ESCARRO / MATERIAS DE ORIGEM PULMONAR
BACILOSCOPIA (ZIEHL)
BACILOSCOPIA Tratado (ZIEHL)
Semeadura
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M. tuberculosis - BACILOSCOPIA
Ziehl-Neelsen
Sensibilidade: 5.000 bacilos/mL de amostra
Importante em infecções pulmonares
Valor limitado em infecções urinárias e outras
Exame rápido
Fluorocromo (auramina)
Mais sensível e mais rápido que Ziehl-Neelsen
Exige microscópio de fluorescência 
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Coloração de Ziehl-Neelsen
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GLOBIAS
Coloração de Ziehl-Neelsen
M. leprae
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M. tuberculosis - colorações
Auramina
É indicado como método de triagem com objetiva de 40X. As lâminas positivas devem ser observadas pelo Ziehl-Neelsen
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Roteiro para baciloscopia de escarro - Ziehl-Neelsen
Fucsina fenicada
Cobrir a lâmina Aquecer 3 vezes 5’
Lavar a lâmina com água corrente
Descoloração álcool-ácido
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Lavar a lâmina com água corrente
Azul de metileno Corar a lâmina 30’’
Após coloração,aguardar a secagem das lâminas e leitura no M.O
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Coloração de Zielh-Neelsen
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Escala semi-quantitativa para informe do número de BAAR em esfregaços de escarro corados pelo Ziehl-Neelsen
Não foram encontrados BAAR em 100 campos = NEGATIVO
 1 a 9 BAAR em 100 campos = relatar o número
10 a 99 BAAR em 100 campos (menos de 1pc) = +
1 a 10 BAAR por campo em 50 campos = ++
> 10 BAAR por campo em 20 campos = +++
observados em imersão
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Esfregaços adequados
Esfregaços inadequados
Escarro
 Baciloscopia: qualidade da amostra
Escarro
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Micobactérias atípicas ou não do complexo M. tuberculosis
 MNT são encontradas no solo e fontes de água.
São classificadas de acordo com:
Tempo de crescimento 
rápido ( < sete dias) 
lento ( sete dias ou mais). 
Presença ou não de pigmento
Capacidade de causar doença no homem 
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Outras micobactérias
Infecções por MNT em pacientes submetidos a procedimentos invasivos:
cirurgias estéticas, 
oftalmológicas e cardíacas, 
acupuntura, 
práticas de pedicuro 
uso de medicamentos injetáveis. 
Espécies de crescimento rápido como : M. fortuitum, M. abscessus e M. chelonae 
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O diagnóstico de doença por MNT 
	Exige muita cautela, pois o seu isolamento a partir de espécimes clínicos não estéreis pode significar colonização transitória ou contaminação. 
	A correlação clínico-laboratorial é de fundamental importância para o diagnóstico de doença por MNT e terapêutica.
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Normas do PNCT para realização da cultura
a) sintomáticos respiratórios com suspeita de TB e baciloscopia repetidamente negativa; 
b) casos suspeitos de TB com amostras paucibacilares e/ou dificuldades de coleta 
c) casos suspeitos de TB extrapulmonar; 
d) pacientes portadores do HIV; 
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e) pacientes com indicação de:
 retratamento após falência ao esquema I, 
TB multiresistente (TBMR) ou recidiva 
reinício de tratamento após abandono; 
f) casos suspeitos 
de infecções causadas por MNT; 
que vivem em instituições fechadas; 
g) estudos epidemiológicos para determinar a prevalência da resistência.
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Identificação de Micobacterias
deverão ser realizados em CSB, classe II, B2 ou B3.
O técnico deverá estar utilizando equipamentos de proteção individual (EPIs), como máscara (N95),luvas e avental.
Os laboratórios devem realizar pelo menos a separação das espécies do complexo M. tuberculosis das MNT
A identificação das MNT pode ser feita por métodos fenotípicos, moleculares ou pela combinação de ambos. 
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M.tuberculosis - Cultura
+ Sensível :(detecta a partir de 10-100 bacilos/amostra)
Meios de cultura (3-4 semanas):
Lowenstein-Jensen (base - ovo)
Midlebrook 7H9(líquido), 7H10, 7H11(agar)
Automação(1-2 semanas)
Bactec, MB/Bact e MGIT (7H9 mod)
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Método barato
Morfologia e outros procedimentos diagnósticos 
Teste de sensibilidade quando indicado
Banco de microrganismos
VANTAGENS
DESVANTAGEM
Crescimento demorado (2-4 semanas)
Cultura e Isolamento
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Fonte: manual ANVISA 2008
Cultura de micobactérias em meio Lowenstein-Jensen. 
A) Mycobacterium tuberculosis; B e C) MNT
Velocidade de crescimento e pigmento
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Sistema MGIT
Detecção/Identificação: PNB e Teste de Sensibilidade
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 Testes moleculares para identificação de micobactérias
Sondas de ácidos nucléicos (GenProbe Inc. San Diego, CA):c. M. tuberculosis, complexo M.avium, M.kansasii, M.gordonae e M.intracellulare
PCR -Padronizado
métodos para amplificação do DNA de micobactérias aprovados pelo FDA para amostras pulmonares com baciloscopia positiva: 
Amplicor e Cobas-Amplicor (Roche Molecular Systems Brancburg, NJ) e AMTD (Gen Probe Inc., San Diego, CA).
Para amostras com baciloscopia negativa
EMTD – nova geração do AMTD (Gen Probe Inc., San Diego, CA).
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Biologia Molecular : 
MULTIPLEX e PRA/PCR
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MULTIPLEX
 Primers específicos para amplificação do gene IS6110 e da proteína 65kDa
Complexo M. tuberculosis
Outras Micobactérias
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 Rapidez (2 a 3 dias) 
Necessita do crescimento no meio sólido 
Separa:
 Complexo MTB de MNT
 Utiliza materiais do MB/Bact e MGIT
 Resultados confiáveis e baixo custo
VANTAGEM
DESVANTAGEM
 Não identifica espécies do Complexo MTB ou das MNT
MULTIPLEX
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TELENTI et al. descreveram um método para diagnóstico diferencial das MNT, chamado PRA (PCR Restriction-enzyme Analysis), baseado na amplificação por PCR do gene hsp65 gene seguido pela digestão do produto amplificado com enzimas de restrição BstE II e Hae III.
J.Clin.Microbiol., 31:175-78, 1993.
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 Amplificação do gene hsp65: sítios polimórficos
 Digestão com enzimas de restrição: HAEIII e BsteII
PCR
BsteII
HaeIII
PRA-PCR
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HaeIII
BstEII
M. abscessus


PRA-PCR
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 Identifica as espécies MNT 
Rapidez
 Utiliza materiais do MB/Bacte Bactec
 Resultados confiáveis
 Baixo custo
VANTAGENS
DESVANTAGEM
 Não separa espécies do Complexo MTB 
PRA-PCR
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Leitura e Interpretação dos Resultados
GenoType Mycobacteria Direct
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GenoType Mycobacterium CM
Leitura e Interpretação dos Resultados
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Resistência
As drogas utilizadas para o tratamento de M. Tuberculosis são:
Rifampicina
Isoniazida
Etambutal
Fluoquinolonas
Drogas Injetáveis
MDR-TB é uma forma específica de TB resistente á medicamentos devido a um bacilo resistente a pelo menos Rifampicina e Isoniazida, as duas drogas mais poderosas contra TB.
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GenoType MTBDRsl
 Controle Conjugado
 Controle de Amplificação
 Controle M. tuberculosis
 Sondas gyrA, rrs, embB
A confirmação da resistência é feita pela ausência de amplificaçaõ da banda WT e aparecimento de uma banda nos pontos de mutação
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