MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR

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Citologia
MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR
(aula 1)
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 MORFOLOGIA, ESTRUTURA, FISIOLOGIA
 TECNOLOGIA DA BIOLOGIA CELULAR
 Microscopia óptica
 Técnicas citoquímicas
 Microscopia eletrônica
 Métodos de isolamento de organelas
 Métodos de isolamento celular
 Cultura celular in vitro
 Métodos de isolamento de moléculas
 Manipulação genética
 Biologia Celular e Molecular
MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR
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 MODELOS CELULARES
 Escherichia coli
Célula bacteriana mais avaliada e conhecida em todo o mundo.
 Saccharomyces cerevisiae
Célula leveduriforme, mais utilizada em estudos de eucariontes unicelulares.
ESTUDO DE CÉLULAS
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 EXAMES DE TECIDOS À FRESCO
 EXAMES DE TECIDOS MORTOS E PRESERVADOS
 PROBLEMAS:
 Células translúcidas
 Células pequenas e complexas
 VISUALIZAÇÃO: - Coloração
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
 Montagem total
Fino ou transparente para ser posto em lâmina.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
 Esfregaço
Fluidos corpóreos são postos em lâmina e é feito um deslizamento do material.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
 Espalhamento
Raspagem de mucosas; o material é deslizado em lâmina.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
 Esmagamento
Esmaga-se o material com lamínula. Útil para estudo de divisão celular e núcleos interfásicos.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
 Decalque
Fragmentos de órgãos moles são pressionados contra a lâmina; os núcleos celulares ficam impressos na lâmina.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
 Corte histológico
São feitos corte extremamente finos de tecido para fixação em lâmina.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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 FIXAÇÃO DE TECIDOS
 Formol, Glutaraldeído, Misturas fixadoras...
 PREPARAÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOS
 Cortes de tecido
 Desidratação
 Diafanização
 Infiltração / impregnação
 Cortes em m
 Coloração
 Montagem
 Visualização
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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Desidratação
Diafanização
Infiltração
Microtomia
Coloração
Montagem
Fixação
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Infiltração
Fixação
Química: - Aldeídos
	 - Mercuriais
	 - Alcoólicos
Física:	- Congelamento e dessecação
	- Calor
	- Ar seco
Parafina
Metacrilatos
Gelatinas
Resinas plásticas
etc...
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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Colorações
SIMPLES: 
- Corantes Básicos 
	Hematoxilina (roxo)
	Azul de toluidina e Guinsa
	Azul de metileno
- Corantes Ácidos
	Eosina (rosa)
	Orange G
	Fucsina ácida
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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ESPECIAIS:
 Citoquímica / Histoquímica: Identificação de moléculas nas células
 PAS (Periodic acid Schiff): identifica GLICOGÊNIO e GLICOPROTEÌNAS
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
Colorações
Reação com PAS:
reações de oxidação e coloração
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ESPECIAIS:
 Citoquímica / Histoquímica: Identificação de moléculas nas células
 Feulgen: identifica DNA
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
Colorações
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ESPECIAIS:
 Citoquímica / Histoquímica: Identificação de moléculas nas células
 Substratos de Enzimas: identifica atividade de ENZIMAS.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
Colorações
Reação com Fosfatase Ácida
Reação com Fosfatase Alcalina
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ESPECIAIS:
 Citoquímica / Histoquímica: Identificação de moléculas nas células
 Sudan Black, Sudan III, Azul de Nilo: identifica LIPÌDEOS.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
Colorações
Coloração com Sudan Black e Sudan III
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ESPECIAIS:
 Citoquímica / Histoquímica: Identificação de moléculas nas células
 Ribonuclease: identifica RNA;
 Formaldeído: identifica CATECOLAMINAS;
 Técnicas variadas: identificam AMINOÁCIDOS
Técnica de Millon – tirosina
Técnica do diaminoazobenzeno – triptofano
Técnica de Sakaguchi - arginina
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
Colorações
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ESPECIAIS:
 Imunocitoquímica / Imunohistoquímica: Identificação de moléculas específicas nas células, excluindo todas as outras;
- Baseia-se na reação antígeno-anticorpo.
 MÉTODO DIRETO: utiliza um anticorpo marcado;
- Peroxidase
- Corantes fluorescentes
- Ferritina
- Ouro coloidal + Proteína A
 MÉTODO INDIRETO: utiliza uma antigamaglobulina marcada.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
Colorações
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MÉTODO DIRETO: utiliza um anticorpo marcado;
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MÉTODO INDIRETO: utiliza uma antigamaglobulina marcada;
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Imunohistoquímica
Imunofluorescência
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RADIOAUTOGRAFIA
 Determina o local de síntese de macromoléculas e seus destinos na célula.
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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Síntese de RNA
Marcação de DNA
RADIOAUTOGRAFIA
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA
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 CENTRIFUGAÇÃO
 Permite isolar organelas de homogeneizados celulares, para análises químicas, físicas e biológicas;
 O isolamento de uma organela depende de:
	- seu coeficiente de sedimentação;
	- densidade e viscosidade da solução.
 Centrifugação Fracionada;
 Centrifugação Contra Gradiente.
SEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARES
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Centrifugação Fracionada
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Centrifugação Fracionada
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Centrifugação Contra Gradiente
 CENTRIFUGAÇÃO
SEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARES
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 FACS
 Permite isolar células marcadas por anticorpo fluorescente.
SEPARAÇÃO DE CÉLULAS
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 Três tipos de céulas animais podem ser cultivadas no laboratório:
 Linhagens celulares primárias
	- crescem e se dividem por um número finito de gerações celulares.
 Linhagens celulares imortalizadas
	- derivadas de linhagens primárias, mas têm capacidade de se dividir indefinidamente.
 Células Cancerosas
	- mostram propriedades características de câncer e são também imortais.
CULTURA DE CÉLULAS
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CULTURA DE CÉLULAS
Células em cultura.
(A) Fibroblastos em cultura.
(B) Mioblastos se fundindo para formar as células musculares multinucleadas.
(C) Oligodendrócito – célula precursora
(D) Células imortalizadas de tabaco
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CULTURA DE CÉLULAS
 APLICAÇÕES:
 Cultivo de órgãos embrionários;
 Produção de vegetais a partir de células totipotentes;
 Estudo do metabolismo de células tumorais;
 Estudo das interações célula-célula;
 Estudo das relações entre células e vírus;
 Pesquisas citogenéticas (diagnóstico de doenças causadas por anomalias cromossomais);
 Pesquisas sobre os requerimentos nutricionais das células.
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Mono-ocular
Binocular
Múltiplos observadores
MICROSCOPIA
 MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE LUZ)
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 MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE LUZ)
 Microscópio de Polarização:
Permite estudar aspectos sobre a organização molecular da célula.
MICROSCOPIA
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 MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE LUZ)
 Microscópio de Contraste de Fase e de Contraste Interferencial :
Útil especialmente para o estudo de células vivas, cultivadas, sem uso de corantes.
Contraste de Fase
Campo escuro
Comum
Contraste Interferencial
MICROSCOPIA
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 MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE LUZ)
 Microscópio Confocal:
Oferece imagens de células que podem ser combinadas para formar uma imagem tridimensional.
MICROSCOPIA
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 MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE LUZ)
 Microscópio de Fluorescência:
Promove a identificação de compostos naturalmente fluorescentes (clorofila, lignina, elastina, colágeno...) e identificação e localização de compostos que reagem com fluorocromos.
MICROSCOPIA
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ME de Transmissão
ME de Varredura
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
MICROSCOPIA
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ME de Transmissão
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO
Um feixe de elétrons interage com o material, atravessando-o para transmitir a imagem.
MICROSCOPIA
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 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
Um feixe de elétrons bombardeia
a superfície do material “varrendo-a”; então, elétrons secundários ou refletidos são utilizados para obter imagens tridimensionais.
ME de Varredura
MICROSCOPIA
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FIM