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1. Considerações e estrutura: ENZIMAS A exceção de alguns RNAs (Ribozimas síntese de proteínas) que apresentam atividade catalítica, todas as enzimas são proteínas que atuam em reações químicas. A atividade catalítica de uma enzima está relacionada à sua perfeita conformação, ou seja, perfeita estrutura. Logo, proteína (enzima) degradada ou desnaturada possui baixa atividade ou ainda atividade nula. Algumas enzimas agem sozinhas !!! Outras, precisam de um grupo químico adicional chamado cofator (íons metálicos) ou coenzimas (moléculas orgânicas) Estrutura Enzimática (Proteínas) Se covalente: Apoenzima ou Apoproteína Holoenzima Cofator Proteína Pode ser: • íon inorgânico • molécula orgânica Coenzima Grupo Prostético Enzimas podem possuir uma ou mais subunidades. No último caso, as subunidades podem apresentar diferentes papéis no funcionamento da enzima. Toda enzima apresenta duas regiões importantes: CENTRO ATIVO E SÍTIO ATIVO Centro ativo: região da enzima onde se localiza o sítio ativo Ex) 130 aminoácidos Sítio ativo: Local exato do centro ativo onde o substrato se liga e ocorre a reação química Ex) poucos aminoácidos 2. Nomenclatura e classes de enzimas de acordo com o tipo de reação que catalisam 1955 - Comissão de Enzimas (EC) - União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar as enzimas de acordo com o tipo de reação catalisada: Ex) CATALASE EC 1.11.1.6 DISMUTASE DO SUPERÓXIDO EC 1.15.1.1 REDUTASE DA GLUTATIONA EC 1.6.4.2 1° dígito - classe 2° dígito - subclasse 3° dígito - sub-subclasse 4° dígito - indica o substrato ADP + D-Glicose-6-fosfato ATP + D-Glicose IUB - ATP:glicose fosfotransferase E.C. 2.7.1.1 2 - classe - Transferase 7 - subclasse - Fosfotransferases 1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila como receptor 1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato Nome trivial: Hexocinase 1. Óxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons) 1.1.atuando em CH-OH 1.2.atuando em C=O 1.3.atuando em C=O- 1.4.atuando em CH-NH2 1.5.atuando em CH-NH- 1.6.atuando em NADH, NADPH 2. Transferases (transferem grupos funcionais entre moléculas) 2.1.grupos com um carbono 2.2.grupos aldeído ou cetona 2.3.grupos acil 2.4.grupos glicosil 2.7.grupos fosfatos 2.8.grupos contendo enxofre 3. Hidrolases (reações de hidrólise) 3.1.ésteres 3.2.ligações glicosídicas 3.4.ligações peptídicas 3.5.outras ligações C-N 3.6.anidridos ácidos Classes de enzimas 4. Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico) 4.1. =C=C= 4.2. =C=O 4.3. =C=N- 5. Isomerases (transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros) 5.1.racemases 6. Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré- existentes, sempre às custas de energia) 6.1. C-O 6.2. C-S 6.3. C-N 6.4. C-C Keq não é afetada pela enzima Enzimas diminuem a energia de ativação da reação Não apresentam efeito termodinâmico global G não é afetada pela enzima As enzimas não são consumidas na reação desde que não haja alterações consideráveis no pH e temperatura do meio 2. Reações químicas catalisadas por enzimas O que acontece no ES ?????????????? Alinhamento dos grupos que irão reagir Formação de cargas transientes e instáveis Rearranjo de ligações químicas Outras transformações...(transferências de grupos entre moléculas!!!!) 3. Termodinâmica de uma reação EP > ER G = EP – ER G = + Entrada de energia!!! Reação Endergônica ER > EP G = EP – ER G = - Liberação de energia!!! Reação Exergônica EAT R P PT G E n e rg ia Progresso da reação EAT R P PT G EAT EAT Progresso da reação 10 30 90 30 90 Presença de enzima Ausência de enzima EA2 – energia de ativação com E EA1 – energia de ativação sem E R - Reagente(s) P - Produto PT – ponto de transição G – variação da energia livre de Gibbs 10 20 20 4. Especificidade Enzima x Substrato 3.1. Absoluta: quando a enzima possui um único substrato Aspartase Ex) L-Asp Fumarato + NH4 + D-Asp ou L-Glu 3.2. Relativa: quando a enzima “aceita” mais de um substrato com característica similar a do seu substrato verdadeiro Hexocinase Ex) Glicose + ATP Glicose-6-P + ADP Manose ou Frutose (substratos alternativos) 3.3. Estereoespecificidade: quando a enzima é específica a um determinado isômero L-AA oxidase Ex) L-AA + O2 + H2O a-cetoácido + NH4 + + H2O2 D-AA oxidase Ex) D-AA + O2 + H2O a-cetoácido + NH4 + + H2O2 REAÇÕES QUÍMICAS COM MAIS DE UM SUBSTRATO PARA A MESMA ENZIMA E´ - Enzima modificada por transferência de algum grupo funcional de S E Geralmente ocorre por meio de ligação covalente A E´ transfere o grupo funcional para o S2 e se regenera, voltando a E 5. Cinética Enzimática Estudo das velocidades das reações enzimáticas e como elas mudam em resposta a alterações dos parâmetros experimentais, principalmente com relação à [ S ] 5.1. Cinética de Michaelis-Menten A maioria das enzimas obedece este padrão Caracterizado por uma HIPÉRBOLE Vo aumenta com o incremento da [ S ] A baixas [ S ], o aumento de Vo é praticamente linear com o aumento de [ S ] Sob altas [ S ], o aumento de Vo deixa de ser linear, até que alcança um ponto no qual a partir dele o aumento em [ S ] não reflete em aumentos significantes de Vo Velocidade máxima da reação (Vmax) Em Vmax, a enzima está SATURADA por substrato Efeito do substrato na porção linear da hipérbole de Michaelis-Menten SEGUNDO MICHAELIS-MENTEN: “ A velocidade de formação de ES é igual a velocidade de dissociação de ES em (E + S) e/ou (E + P)”. Então: V = k1 [E] [S] formação de ES V = K2 [ES] dissociação de ES V = K -1 [ES] k1 [E] [S] = K2 [ES] + K -1 [ES] Km = K -1 - K2 K1 Km = constante de Michaelis-Mentem Equação de Michaelis-Menten SIGNIFICADO PRÁTICO DO Km Km = 1 Vmax 2 O Km é a concentração de S quecorresponde a metade de Vmax Ao se determinar a atividade de uma enzima trabalha-se com [S] igual ao Km, pois teremos certeza de que estaremos na porção linear da curva. O Km é característico para uma enzima em relação ao seu substrato. Quanto menor o Km maior a afinidade da enzima para com o substrato Enzima Substrato Km (mM) Catalase H2O2 25 Hoxoquinase Glicose Frutose 0,15 1,5 Quimiotripsina N-benzoltirosinamida N-formiltirosinamida N-acetiltirosianamida Gliciltirosinamida 2,5 12,0 32 122 Anidrase carbônica HCO3 - 9,0 Glutamato desidrogenase Glutamato a-cetoglutarato NH4 + NADox NADred 0,12 2,0 57 0,025 0,018 Aspartato amininotransferase Aspartato a-cetoglutarato Oxalacetato Glutamato 0,9 0,1 0,04 4,0 OBS: Transformação da função cinética de Michaelis-Mentem (Hipérbole) em função linear: Duplo-recíproco ou Gráfico de Lineweaver-Burk 1 = Km + [S] Vo Vmax[S] 1 = Km + 1 Vo Vmax[S] Vmax A função linear elimina possíveis subestimação dos parâmetros cinéticos sob baixas [ S ] OBS: CONSTANTE CATALÍTICA KCAT AFINIDADE Vo = KCAT [ S ] [ E ] Km KCAT = s -1 M-1 ESPECIFICIDADE Km KCAT / Km Km = Quanto menor o Km, maior a AFINIDADE da enzima pelo substrato KCAT = Quanto maior o KCAT, maior a velocidade de catálise da reação (ou seja, maior a velocidade de transformação de substrato em produto). Logo, maior a ESPECIFICIDADE 1 / KCAT = 1 / no. muito grande O inverso do KCAT resulta em um número muito pequeno e significa a velocidade de catálise para a formação de um único produto a partir de um único substrato Muito comum em rotas metabólicas e geralmente é a primeira enzima da rota (papel regulatório) Em geral, enzimas alostéricas possuem estruturas maiores que enzimas não- alostéricas, possuindo mais de uma cadeia polipeptídica O sítio ativo para substrato pode ocorrer em uma cadeia e para o regulador (ativador ou inibidor) em outra, ou em alguns casos ambos os sítios ocorrem na mesma cadeia Podem sofrer regulação por ligação covalente ou não Funcionamento: Propõe-se que cada subunidade de uma enzima alostérica funcione com cinética de M-Menten. A saturação da enzima pelo S ocorre primeiro em um sítio ativo e depois em outro Quando a E alostérica possui mais de uma sub- unidade, e estas estão ligadas, passam a funcio- nar com cinética própria e diferente de M-Menten Nesse caso o Km K0,5 5.2. Enzimas alostéricas Papel regulatório: Cinética de ENZIMAS ALOSTÉRICAS Sigmóide EM GERAL, observa-se que para E alostéricas, a velocidade inicial da reação não aumenta linearmente com o aumento de substrato. Isso só é observado posteriormente!! Saturam quando a concentração de substrato é alta NÃO CONFUNDIR: DESNATURAÇÃO ENZIMÁTICA & INIBIÇÃO ENZIMÁTICA 6. DESNATURAÇÃO E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Considerando-se enzimas como proteínas, infere-se que qualquer fator que desnature proteína desnature enzimas. Os agentes de desnaturação causam alterações no centro e sítio ativo da enzima, prejudicando a formação do complexo ES Não esquecer que a desnaturação pode ser: PARCIAL: baixa atividade em relação ao ótimo TOTAL: atividade nula (= zero) Temperatura e pH são os principais fatores no meio celular DESNATURAÇÃO ENZIMÁTICA Enzima Temperatura ótima Papaina 68º C Catalase 30º C Isocitrato desidrogenase 35º C Efeito da temperatura Enzima pH ótimo Lipase (pancreas) 8.0 Lipase (stomach) 4.0 - 5.0 Lipase (castor oil) 4.7 Pepsin 1.5 - 1.6 Trypsin 7.8 - 8.7 Urease 7.0 Invertase 4.5 Maltase 6.1 - 6.8 Amylase (pancreas) 6.7 - 7.0 Amylase (malt) 4.6 - 5.2 Catalase 7.0 Efeito do pH Resulta da ação de moléculas chamadas de INIBIDORES ENZIMÁTICOS que atuam diminuindo a atividade de catálise da enzima (ou até mesmo, tornando-a nula) Pode ser: REVERSÍVEL: enquanto presente altera a atividade da enzima, porém, pode ser retirado da enzima e a mesma recupera sua atividade. Pode ocorrer das seguintes formas: - Competitiva - Não-competitiva - Mista IRREVERSÍVEL: se liga ao sítio ativo da enzima definitivamente INIBIÇÃO ENZIMÁTICA INIBIÇÃO COMPETITIVA Resulta da ação de INIBIDOR COMPETITIVO, que disputa com o substrato pelo pelo mesmo sítio de ligação na enzima Só se liga à ENZIMA LIVRE Pode ser revertida aumentando-se a [ S ] Quanto mais inibidor no meio, maior a [ S ] para reverter a inibição Aumenta o Km, mas não altera a Vmax INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA ou ACOMPETITIVA Resulta da ação de INIBIDOR NÃO-COMPETITIVO, que se liga em outro sítio que não o sítio de ligação do substrato Só se liga à ENZIMA após esta ter ligado seu substrato, ou seja, só se liga após a formação de ES Reduz o Km e Vmax INIBIÇÃO MISTA Resulta da ação de INIBIDOR MISTO, que se liga em outro sítio que não o sítio de ligação do substrato Se liga à ENZIMA em qualquer situação Aumenta o Km e reduz o Vmax I INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Resulta da ação de INIBIDOR IRREVERSÍVEL, que se liga APENAS ao sítio ativo do substrato impedindo a ligação deste e formação de produto Essa ligação geralmente é de forma covalente e forte X X
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