Espectrofotometria e Introduçao Laboratorio de Bioquimica

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Juliana Leal Rocha
Antonio Abatepaulo
FAMEBLU
 Material humano
 secreções
 líquidos
 excreções
 fragmentos de tecidos
 Amostras biológicas analisadas: 
 sangue (soro ou plasma)
 urina
 esperma
 líquidos orgânicos (líquor, líquidos cavitários, 
sinovial, amniótico
 Parte líquida = 55%
 Elementos sólidos = 45%
 Parte líquida
 plasma ou soro
 Elementos sólidos 
• Glóbulos brancos
• Plaquetas*
• Glóbulos vermelhos
 Principais exames realizados
 Dosagem de compostos orgânicos 
 Açúcares 
 Lipídios e lipoproteínas 
 Proteínas (enzimas, apoproteínas, Hb glicada, 
proteínas plasmáticas, aminoácidos, etc.)
 Bilirrubina, amônia
 Urobilinogênio, creatinina, ácido úrico, etc.
 Dosagem de vitaminas
 Dosagem de compostos inorgânicos (cálcio, fosfato, 
magnésio, sódio, cloretos, potássio, ferro, etc.)
 Determinação do pH, etc.
 Principais técnicas utilizadas
 Cromatografia
 Espectrofotometria
 colorimetria (colorimétrico ou enzimático 
colorimétrico)
 cinético e cinético enzimático
 Química seca, etc.
 ESPECTROFOTOMETRIA
ESPECTROFOTÔMETRO
Medida da absorção de luz por um composto 
em solução para analisar sua presença e 
concentração.
• Medida de absorção de luz por um composto 
em solução.
O QUE É 
ESPECTROFOTOMETRIA??
Luz visível 
• É uma forma de radiação eletromagnética
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
São ondas que se autopropagam pelo espaço.
• Propagação em 
ondas com 
diferentes 
comprimentos e 
frequência

comprimento de onda ( ): distância 
linear entre as 2 cristas. Medida 
em nanômetro – nm (1nm = 10-9m)
frequência: taxa de oscilação da 
onda. Medida em hertz – hz (1 hz = 
1 oscilação/s)
Ondas 
longas 
Ondas
curtas
• Tipos de ondas utilizadas na espectrofotometria
– ultravioleta = 100 - 379 nm (análises bioquímicas)
– visível = 380 – 750 nm (análises bioquímicas)
– infravermelho = 750 – 2000 nm
Luz visível
 (nm)
• Ampla variedade de moléculas absorve luz 
em comprimentos de onda característicos
Absorção de luz pelas moléculas
CORANTES
HISTOLÓGICOS
Curva de absorção espectral
• A medida de absorção de luz é 
utilizada para:
• identificar moléculas (ANÁLISE 
QUALITATIVA)
em solução
• medir suas concentrações em 
solução (ANÁLISE 
QUANTITATIVA-Análises Clínicas)
Transmitância (T) e Absorbância (A)
Quando um feixe de luz monocromática atravessa 
uma solução colorida com moléculas absorventes ...
I0
l
I
T = I/I0 %T = I/I0 x 100
I é menor I0
• ANÁLISE QUANTITATIVA
• Absorbância (A)
É a quantificação matemática da absorção de luz por 
uma solução
I0
l
I
A = log I0/I
I
I
1. A absorção da luz é proporcional a espessura da solução (l) por ela atravessada
• Princípios de absorção da luz - Lei de 
Bouguer-Lambert
I
I
• Princípios de absorção da luz - Lei de 
Lambert-Beer
2. A absorção da luz é proporcional a concentração do soluto presente na solução 
por ela atravessada
log Io/I = Absorbância (A)
A relação entre A e a concentração de soluto presente na 
solução é proporcional = linear crescente
Glicose (umoL) 
Curva de absorbância x concentração 
log (Io/I) = Absorbância (A)
I/Io = Transmitância (T)
ESPECTROFOTÔMETRO
COMPONENTES BÁSICOS DO 
ESPECTROFOTÔMETRO
COMPONENTES BÁSICOS DO ESPECTROFOTÔMETRO
Fontes de energia elétrica (tomada) e radiante (lâmpada)
Colimador (focaliza o feixe de luz)
Prisma (decompõe o feixe de luz em violeta, azul, verde, amarelo, laranja,
vermelho e infravermelho)
Fenda (isola comprimentos de onda específicos )
Cubeta (contém a solução a ser medida)
Fotocélula (detecta e mede a luz transmitida, convertendo o sinal óptico em
sinal elétrico) = TRANSDUTOR DE ENTRADA
Galvanômetro (converte a medida do sinal elétrico em números de
Absorbância – 0,0 a 2,0) = TRANSDUTOR DE SAÍDA
Exemplo: Dosagem de GLICOSE no plasma (reação 
colorimétrica enzimática)
**Absorbância (Abs) é fornecida pelo espectrofotômetro.
Aplicação da espectrofotometria no 
laboratório de Bioquímica
Exemplo: Dosagem de colesterol no soro (reação colorimétrica 
enzimática)
Composto colorido ( = 500 nm)
(Quanto mais intensa a cor, maior é
a concentração de quinoamina)
ANÁLISE QUANTITATIVA DE ESPÉCIES 
QUÍMICAS EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS
Para realização da dosagem de uma determinada espécie química 
(ex. colesterol) utiliza-se :
a) Branco: solução que contém todas as espécies químicas menos a 
substância a ser dosada (serve para zerar o aparelho).
b) Padrão: solução contendo uma concentração conhecida da 
espécie química a ser analisada.
c) Amostra: solução teste.
Cálculo para determinação da 
concentração de colesterol na amostra
a partir das absorbâncias do padrão e 
da amostra
Portanto a 
espectrofotometria é...
Método que utiliza a capacidade que determinados 
compostos químicos têm de absorver e refletir 
determinados comprimentos de onda, para analisar 
qualitativamente ou quantitativa amostras biológicas ou 
moléculas