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estrategias purificacao analises proteínas (1)

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Fundamentos de Proteínas
Aula 3 – Estratégias de Purificação e Análises de Proteínas
BCM13042
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Principais componentes moleculares da bactéria E. coli
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. 
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
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 Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
	1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifuação, diálise, gel-filtração)	
 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) 
 Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas 
 moléculas:
 
 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que 
 interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
 
Métodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
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O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas. 
Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequente-mente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura. 
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 Medida da atividade biológica
 - particular para cada proteína
 - deve ser quantitativa, para estimar quanto da proteína de interesse há em cada fração.
 Medidas do conteúdo proteico (diversos)
 - absorbância de luz UV de 280 nm
 - métodos colorimétricos 
 (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
Além dos métodos de purificação, análises complementares devem ser feitas ao longo da purificação, para verificar se o processo de separação está sendo eficiente.
A medida da atividade biológica da proteína de interesse e do conteúdo de proteínas de cada fração resultante do processo de separação devem ser feitas a cada passo. Assim, apenas a fração que contém a proteína de interesse, marcada com um círculo vermelho no fluxograma, é submetida à próxima etapa de purificação.
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Métodos para medida do conteúdo de proteína:
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, especialmente triptofano. 
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
Ácidos nucleicos também absorvem luz UV – máxomo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1
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BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250
 Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas.
 Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina.
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul, 
Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato 
 Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 
 
1. Cu2+ é chelado pela proteína
 [Cu2+-proteina]
2. Reação redox 
 Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína] 
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul.
Método de Lowry
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
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Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). 
Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.
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Sendo a proteína de interesse uma proteína de membrana, é necessário solubilizá-la. Para esse fim são utilizados detergentes, que dissolvem a membrana plasmática e formando complexos solúveis com as proteínas.
Detergentes podem ser iônicos e não iônicos
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sangue centrifugado: separação de plasma e células
 A centrifugação frequentemente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. 
 Através de sucessivas etapas de centrifução com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se obter diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos.
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R$ 3.000
US$ 70,000
Centrífuga
Clínica
Ultracentrífuga
Força centrífuga
1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas
200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos
(necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração)
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Preço aproximado
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.
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Centrifugação em gradiente de densidade
A centrifugação em um meio com gradiente de densidade melhora a eficiência da separação. As partículas se deslocarão através do gradiente até encontrarem uma região com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando “bandas”.
Gradientes podem ser utilizados para separar diferentes tipos de células, organelas, ácidos nucléicos, complexos proteicos, etc.
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As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
	- adição de sais (Precipitação salina)
	- adição de solventes
	- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
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Sais se dissociam em solucão aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.
Considere uma solução com fibrinogênio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observe o gráfico.
Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4, pode-se purificar completamente o fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois este precipita totalmente
em uma saturação de 2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a solução e o fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Numa próxima etapa, adicionando-se mais sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos também purificada a mioglobina, ainda em solúvel na presença de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante.
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Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. 
Os mais utilizados são etanol e acetona. 
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou 
 quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. 
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
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Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros 
 tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
início
final
Dt
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Até o momento, exploramos as etapas iniciais de purificação de proteínas, como a centrifugação diferencial e precipitação fracionada.
Esses métodos, apesar de terem baixo poder de resolução (exploram diferenças grosseiras entre as proteínas), permitem processar grandes volumes ou massas, típicos das etapas iniciais de isolamento. 
Quando já houve redução significa-tiva dos montantes de proteínas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que irão explorar as diferenças mais sutis entre as moléculas.
Não esquecer que todas as frações obtidas devem ter o conteúdo de proteínas e de atividade biológica medidos, para se decidir qual/quais deverão passar para o passo seguinte da purificação.
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Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
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 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
 Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida 
 através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes 
 em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
 Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína 
 de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades 
 específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
 Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de 
 partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é 	 	 inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces-	 	 sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas 
 que apresentam pouca atividade). 
	 
	 Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às 	 	 diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes 	 
	 etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de 	 interesse. 
 
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Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica 
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. 
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como:
 massa molecular
 carga elétrica
 solubilidade
 afinidade
 
Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.
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Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular 
 grãos (beads) da resina com poros 
 Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. 
 Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). 
 Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
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Absorbância a 280 nm
volume
Medida da ativ. biológica
Moléculas maiores
Moléculas menores
Kav
Massa molecular (kD)
 20 40 60 80 100 120 mL 
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. 
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.
Curva de calibração
Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao.
Ler a massa correspondente
Observar a escala log
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Moléculas pequenas
Moléculas pequenas
Proteínas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas
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Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. 
Ve – volume de eluição de uma certa proteína
Vt – volume total da coluna
Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com 
 massa acima da resolução da resina 
onde:
O gel nessa coluna é o Sephadex G-200, cuja faixa de resolução de proteínas é de 5.000 a 600.000 d.
Observe como proteínas nos extremos da faixa de resolução tendem a “sair” da parte linear da curva.
Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de gel-filtração.
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Cromatografia de troca iônica 
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
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DEAE-celulose - pH < 10
CM-celulose - pH > 4
Cromatografia de troca iônica 
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
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Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica 
Adsorção
Eluição
Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl- +
A cromatografia
de troca iônica compreende duas etapas: 
adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; 
eluição das proteínas adsorvidas.
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. 
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna.
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Carboximetil~celulose
(trocadora de cátions)
Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de ânions)
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica
 Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição. 
 As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).
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Tipos de Resina de troca Iônica
 Tipos de Resina de troca iônica 
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
−Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3	
—CH2-SO3-	
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Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao 
 ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou 
 por competição com o ligante livre
Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. 
A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). 
Ex: cromatografia de imunoafinidade
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1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo
	- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
	- agonistas ou antagonistas de receptores
	- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
	- ligantes com “tag” ou “marcação”
		- glutationa-S-transferase
		- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP)
 Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade 
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Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina. 
 A introdução de um braço espaçador diminue esse risco.
Preparo da resina de afinidade: 
Passo 1. Ativação da resina
				
				 
 Passo 2. Acoplar 
 o ligante 
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Cromatografia de Partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc.
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico.
Consiste de 2 sistemas:
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HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias. 
Característica diferencial da cromatografia convencional: 
 partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) 
 aumento da eficiência da separação em função do número maior de partículas 	 de resina em um mesmo volume da coluna 
 fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna
Desenho básico de um HPLC
Duas bombas permitem eluição em gradiente
Detector: índice de refração, absorbância UV 	ou Vis, fluorescência, etc.
Coluna pode ser aquecida para melhorar a 		eluição diferencial na fase reversa
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Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas)
Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água
	- acetonitrila, metanol, propanol
Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C
Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila
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 Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número e tipos) de seus aminoácidos. 
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Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos atualmente mais utilizados:
Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal. 
Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.
 Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e proteômica. 
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Método de Edman - sequenciamento de proteínas com PITC (fenil-isotiocianato)
Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:
Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);
Hidrólise ácida da proteína conjugada com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S);
Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o novo N-terminal da proteína. 
Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de proteína. 
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Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman. 
Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição de suas sequências.
Proteína
Total 150 a.a
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Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas
Para sequenciar proteínas é preciso obter o espectro MS/MS de seus peptídeos.
Isso significa 2 etapas de MS acopladas. 
Depois de fazer o MS da molécula inteira, esta é fragmentada dentro do aparelho por colisão com gases.
Os fragmentos são então separados e analisados por MS.
hélio ou argônio
A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido.
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Espectro MS/MS do peptídeo tríptico GLSDGEWQQVLNVWGK. 
Analiza-se o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer a seqüência do peptídeos
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Síntese de peptídeos
Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004
DNA recombinante
Química: uso de reagente químico para ativar o ácido carboxílico de um Nα-acil-aminoácido, o qual sofre o ataque nucleofílico do grupo α- amino de outro aminoácido 
 - indicado para sequências de até 20 aa. 
 - estereo-isômeros, purificação dos produtos
Biocatálise: reversão da proteólise
 - diminuição da atividade da água no meio reacional reverte a ação de enzimas proteolíticas
- termolisina, pepsina, subtilisina, tripsina, etc
 - vantagens:, não forma misturas racêmicas e 
 sub-produtos, 	condições brandas 	
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Síntese de peptídeos
Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila, estável ao ácido trifluoroacético (TFA) e lábil a bases orgânicas – todas as outras carboxilas são protegidas por reagentes lábeis ao TFA e estáveis a bases orgânicas
Boc (t-butiloxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila lábil ao (TFA) – todas as outras carboxilas são protegidas por reagentes estáveis a este ácido e lábeis a ácidos inorgânicos fortes ou hidrogenólise.
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Síntese de peptídeos
Robert B. Merrifield – Prêmio Nobel em Química em 1984
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Síntese de peptídeos
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ELETROFORESE
 ELETROFORESE
1. pH / tampão
2. Suporte
-
papel : corrente alta (calor)
uso para peptídeos e aminoácidos
-
agarose
: ácidos nucléicos 
Imunoeletroforese
Proteínas nativas
CONDIÇÕES QUE DETERMINAM A SEPARAÇÃO
*
Reação de eletrólise da água
 Uso de tampão concentrado
 Uso de indicador de pH como marcador de corrida: 
 azul de bromofenol
*
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
 7 a 15% [acrilamida] – maioria das proteínas
 [ ] mais baixas – gel muito mole – 
 suporte com agarose
 Gradiente de acrilamida – aumenta poder de resolução
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
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155.000
330.000
18.000
64.000
 Separação na eletroforese nativa é influenciada pela carga, massa e forma da molécula
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SDS (dodecil sulfato de sódio
 +
 2-mercaptoetanol
Efeitos do SDS
 desnaturação uniformiza a forma das proteínas; 
 mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas migrem para o anôdo;
 facilita o efeito de redutores 
*
SDS-PAGE 
Salmonella tiphymurium
*
Determinação da massa molecular de proteínas
Curva de calibração de SDS-PAGE a 15%
*
•
migração através de um gradiente de pH
•
proteínas “focalizam” nos seus P.I.
Anfólitos: Misturas de compostos poliaminados/policarboxilados (patenteados)
Gel não tamponado polimerizado com anfólitos
1ª corrida: anfólitos criam gradiente
2ª corrida: amostras são aplicadas
Após a corrida: pedaços do gel são analisados quanto ao seu pH.
3.0
4.0
5.0
6.0
pH
pH
+
Marcadores de P.I. conhecidos
_
Aplicações:
Determinação do PI
Isoformas da mesma proteína:
 glicosilação
 fosforilação
 mutações pontuais
 Eletroforese – focalização isoelétrica 
*
1a.dimensão: focalização isoelétrica
2a.dimensão: SDS-PAGE (perpendicular a 1a.)
PM x 103 
Eletroforese Bidimensional
*
PROTEOMA:
 análise simultânea de até 5.000 proteínas
 permite comparação de todas as proteínas expressas por uma célula em dois momentos diferentes: 
 análise do efeito de hormônios, 
 análise do efeito de drogas; 
 estados fisiológicos (desenvolvimento);
 condições patológicas diversas (vírus, 
 bactérias,etc.) 
 
Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de Escherichia coli
*
sem fervura das amostras
pode ter SDS no gel de separação
Conformação nativa, oligomerização
Zimogramas: estudos de enzimas, afinidade
Gel copolimerizado (gelatina, amido, etc)
Gel overlay (gel de agarose)
Proteínas nativas ou renaturadas no gel por remoção lenta do SDS por troca com detergente não iônico
Gel nativo: 
*
Antígeno B do Echinococcus granulosus
Multímeros de subunidades de 8 kDa
15% SDS-PAGE
Monteiro et al., 2011
PLoS Neglected Tropical Diseases
Urease de Canavalia ensiformis 
 (hexâmero de 90 kDa)
3% PAGE
Efeito de Cu2+ - precipitação 
Follmer & Carlini, 2005
Arch. Biochem. Biophys.
Ni2+ Cu2+ Zn2+ Hg2+ 
Rhipicephalus microplus Cys-endopeptidase
12% SDS-PAGE- copolimerizado com 0.1 % hemoglobina
 - após corrida, retirada do SDS troca por Triton X-100 (3h)
 - incubação a pH 4,0, 18h/37oC.
 Estrela et al, 2010 
Comp. Biochem. Physiol
 Tolfo Bittencourt et al., 2004 Res. Microbiol 
 8.5% non-denaturing gels
- atividade das SODs revelada Inibição da redução do NBT em presença de TEMED e riboflavina 
Superoxide dismutases from Metarhizium. anisopliae
*
Métodos imunoquímicos aplicados a proteínas 
 estrutura e propriedades de imunoglobulinas
 anticorpos policlonais e monoclonais: produção e purificação
 	
 imunodiagnóstico: aglutinação X lise
	
 imunoprecipitação: difusão em gel, imunoeletroforese
 ELISA, Western blot
 imunohistoquímica e imunofluorescência
*
Anticorpos são imunoglobulinas.
Cadeia H (pesada) – 50.000 d
Cadeia L (leve) – 25.000 d
Porção N-terminal das cadeias L e H
 
 ~ 120 aminoácidos variáveis
 restante da cadeia é constante
*
*
Mecanismos através dos quais os anticorpos executam as funções de defesa:
 Neutralização (Ag solúveis)
 Opsonização (Ag particulados)
 Imunecomplexo (todos Ags)
*
Produção de Anticorpos: imunização ativa
Propagação clonal de linfócitos B ou plasmócitos
Um linfócito B sempre produzirá imunoglobulinas para o mesmo antígeno, mas poderá variar a classe de anticorpos produzidos
*
Anticorpos policlonais versus Anticorpos monoclonais
Há vários determinante antigênico ou epitopo em uma proteína
 - tamanho: 5 a 6 aminoácidos
 - podem ser sequenciais ou conformacionais
*
 Reconhecimento de apenas um determinante antigênico 
 tipo único de imunoglobulina
 
 Vantagens e desvantagens 
Produção de Anticorpos Monoclonais
*
 Imunoprecipitação
Complexos Ag-Ac insolúveis
- Precipitado é máximo na 
Zona de equivalência
- Excesso de Ag ou de Ac
Fazem complexos solúveis
*
Imunoprecipitação em gel de agarose
*
Imunodifusão dupla
Permite comparar antígenos e detectar determinantes antigênicos em comum
Identidade
total
Identidade 
parcial
Ausência de
identidade
*
 
Proteínas bacterianas com afinidade por Imunoglobulinas
- Servem como ligantes em matrix de afinidade
 Servem como 2º.ligantes em testes imunoenzimáticos
bead
*
Imunobeads: adsorção complexo Ag:Ac
*
Ensaios Imunoenzimáticos ou ELISA
+ 1º.Ac + Ag
placa
Ag
Ac 1º.
Ac 2º.
E
S
cor
ELISA
sandwich
+ 2º.Ac + S cor
Padronização do ELISA
Concentração do Ag ou Ac
Abs (intensidade da cor)
*
 
ELISA Competitivo é adequado para identificação e quantificação tanto do antígeno como do anticorpo.
Para a determinação de Ag, o Ag presente na amostra compete com Ag marcado com uma enzima, para se ligar ao Ac imobilizado. A cor desenvolvida na revelação é indiretamente proporcional à concentração de Ag na amostra. 
O Radioimunoensaio (RIA) baseia-se no mesmo princípio, utilizando Ag marcado com um radioisótopo para competir com o Ag frio presente na amostra. 
(1)
(2)
- Quanto maior a concentração do antígeno a ser medido, maior será o deslocamento do antígeno marcado, permitindo a quantificação.
Variante para pesquisa do Ac
*
Western blot
Anticorpo secundário marcado com:
 - enzima
 - radioativo
 - fluorescente 
*
MAP2-(neurons) and GFAP-(astrocytes) positive cells in hippocampal cell culture 
GluR1 clusters in hippocampal cultured neurons 
Presynaptic terminals showned by immunostainig of specifically presynaptic protein Synapsin in cultured hippocampal neuron 
Imunofluorescência:
anticorpos marcados com diferentes fluoróforos
 
 vermelho (rodamina), verde (fluoresceína)

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