HEMOGLOBINAS Geral

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Hemoglobinas normais e patológicas 
Os assuntos abordados nessa aula são:
Relações estrutura X função: comparação com a mioglobina
Aspectos ontogenéticos e filogenéticos
Hemoglobinopatias 
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As globinas constituem um bom exemplo para se compreender as relações entre a estrutura e a função das proteínas. 
A Hemoglobina é um hetero-tetrâmero formada por 2 tipos de globinas: a e b.
Max Perutz e John Kendrew resolveram a estrutura 3D da hemoglobina em 1959
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O ambiente hidrofóbico em torno do heme é fundamental para a atividade biológica das globinas, que depende de uma interação reversível com oxigênio. 
 Fe++ Fe++.O2
A mioglobina da baleia cachalote é uma proteína monomérica de 153 aminoácidos composta por 7 segmentos de a-hélice, denominados de A a H. As porções da cadeia polipeptídica entre segmentos de a-hélice são chamados cotovelos. As globinas apresentam um bolsão (fenda) hidrofóbico no qual se aloja o grupo prostético heme.
Estrutura 3D do esqueleto covalente da mioglobina. 
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Comparação das seqüências de aminoácidos da mioglobina (Mb, 153 aa) e das
globinas a (Hba, 141 aa) e b (Hbb, 146 aa) da hemoglobina de cavalo. 
As seqüências começam com o resíduo N-terminal NA1 (à esquerda, em cima), antes da hélice A, composta por 16 aminoácidos. Segue a hélice B, também com 16 resíduos, e assim até a hélice H. Os aminoácidos idênticos nas três proteínas estão marcados em cinza, e os que interagem com o heme aparecem em rosa. Entre esses últimos estão a His E57 e a His F8 que ocupam a mesma posição espacial nas 3 moléculas, apesar de terem posições diferentes nas seqüências correspondentes. 
Observe que o grau de identidade da seqüência entre as três globinas é relativamente baixo, da ordem de 20% (27 resíduos).
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Comparação das estruturas 3D das globinas a e b da hemoglobina e mioglobina
Observe a semelhança estrutural das 3 globinas, formadas por 
7 segmentos de a-hélice que delimitam uma fenda, na qual se localiza o heme.
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Considerando: 
que a seqüencia de aminoácidos é o que determina a estrutura 3D de uma proteína, 
e o baixo grau de identidade das 3 sequëncias globínicas, 
Como se explica o fato delas possuírem estrutura 3D tão semelhantes ?
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 O heme das globinas é responsável pela ligação ao oxigênio. 
O heme, também presente nos citocromos, é sintetizado nas células aeróbicas através de uma cadeia complexa de enzimas, a via das porfirinas. Na última etapa, um átomo de ferro é introduzido na protoporfirina IX, originando o heme.
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 Nas globinas, o Fe2+ hemínico faz 6 ligações de coordenação: 4 ligações planares com os nitrogênios dos anéis pirrólicos da protoporfirina, e 2 perpendiculares ao plano do heme. A 5ª. ligação é permanentemente ocupada com um dos N imidazólico da histidina F8 (proximal). A sexta coordenação pode ser ocupada pelo oxigênio, ou pela histidina E7 (distal) nas globinas desoxigenadas.
No desenho ao lado, a globina a. Observar os resíduos hidrofóbicos (em preto) que forram o bolsão do heme nas globinas. 
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A Hemoglobina, composta por quatro cadeias polipeptídicas (dois dímeros ab), é uma proteína transportadora de oxigênio.
	apresenta afinidade variável por O2
A estrutura tetramérica da hemoglobina confere à molécula maior controle da afinidade por oxigênio
A Mioglobina, composta por uma cadeia polipeptídica, é uma proteína armazenadora de oxigênio presente no tecido muscular de mamíferos. 
 
 apresenta alta afinidade por O2
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 A Mioglobina (Mb) tem a curva hiperbólica, e atinge 50% de saturação (p50) com uma pO2 de ~1 torr.
 A Hemoglobina (Hb) tem a curva sigmóide, indicando alosteria ou cooperativadade entre suas subunidades. Sua pO2 é de ~ 26 torr e sua afinidade pelo O2 varia com o grau de saturação da molécula.
A curva de saturação com O2 mostra diferenças importantes na afinidade da hemoglobina e da mioglobina pelo oxigênio.
A curva de saturação descreve a percentagem de moléculas carregando O2 (eixo y) à medida que se aumenta a pressão parcial do gás (pO2, eixo x).
Observe os valores da pO2 venosa (nos tecidos) e arterial (nos pulmões).
 A diferença de afinidade por O2 faz com que nos tecidos, a Mb fique 100% saturada, enquanto que a saturação da Hb diminui a ~55%, liberando de 1 a 2 moléculas de O2.
Essa diferença de comportamento está de acordo com a função de armazenamento de O2 da Mb e de transporte de O2 pela Hb.
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Por que a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio é 26 vezes menor do que a da mioglobina, se as proteínas possuem as estruturas 3D de suas cadeias globínicas (ambiente onde está o complexo heme-Fe2+ ~ O2) tão semelhantes ?
Quais são os mecanismos que fazem a afinidade da hemoglobina variar conforme o grau de saturação em O2 ? Por que isso não ocorre com a miglobina ? 
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A hemoglobina passa por várias alterações conformacionais na transição do estado desoxigenado para oxigenado.
No estado oxigenado, a cavidade central do tetrâmero diminue.
Vários “loops” se movem.
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Observar os movimentos da cadeia b em relação ao Heme. A histidina 92 é a F8 proximal.
Alterações conformacionais da hemoglobina A durante a transição do estado oxigenado para desoxigenado
Observar a expansão da cavidade central do tetrâmero e as mudanças nos contactos entre as subunidades
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O estado de oxigenação afeta propriedades físicas da Hemoglobina como a interação com a luz visível.
 A hemoglobina desoxigenada interage mais com a luz azul (absorção no comprimento de onda de 600-650 nm), dando ao sangue venoso uma cor acastanhada (não é sangue sujo !), quando comparado ao sangue arterial.
Alterações conformacionais da hemoglobina A durante a transição do estado oxigenado para desoxigenado
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As alterações conformacionais que ocorrem nas cadeias globínicas da hemoglobina na transição oxigenação-desoxigenação são transmitidas de uma cadeia a outra, através de contactos nas interfaces das subunidades.
Esse fenômeno é a base molecular da cooperatividade, uma forma de alosteria característica de proteínas oligoméricas. Por ser monomérica, a mioglobina não tem essa propriedade.
A cooperatividade na hemoglobina é positiva. Isso significa que quando uma cadeia passa do estado oxigenado para o desoxigenado, as alterações conformacionais que essa molécula sofre são “sentidas” pelas cadeias vizinhas. Essas, por sua vez, respondem com uma diminuição de sua afinidade pelo oxigênio, facilitando a desoxigenação da hemoglobina.
O mesmo tipo de fenômeno ocorre na oxigenação da molécula, que também acontece de forma positivamente cooperativa.
A cooperatividade na transição oxigenação-desoxigenação da hemoglobina é a causa de sua curva de saturação ter aspecto sigmóide, e uma das razões da afinidade variável da hemoglobina pelo oxigênio. 
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O efeito Bohr é a modulação da afinidade da Hb por O2 pelo pH do meio, facilitando a desoxige-nação da Hb a nível tecidual.
O sangue venoso é mais ácido do que o arterial, pela presença de CO2 vindo dos tecidos. Esse forma ácido carbônico H2CO3, que se dissocia liberando H+ para o meio.
A curva ao lado mostra como a % de saturação da Hb, em uma pO2 próxima aos valores nos tecidos (20 torr), diminue em função do pH do meio. 
Vários mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio. 
O efeito Bohr é um dos mais importantes em termos fisiológicos.
Para a mesma pO2, a saturação da Hb diminue de 45% em pH 7,6 para 22% em pH 7,2.
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Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampão.
Nos tecidos, a pO2 é de 25 a 40 torr e o pH ligeiramente mais ácido (7,2-7,3). O CO2 produzido difunde-se para o plasma e para as hemácias.
Nas hemácias, o CO2 é convertido a H2CO3 pela enzima anidrase carbônica.
O H2CO3 se dissocia no íon bicarbonato HCO3- e um próton H+. Parte do HCO3- (~60%) difunde para o plasma, onde constitue o principal sistema tampão.
Uma parte pequena (~8%) do CO2 liga-se diretamente ao resíduo N-terminal de cada globina, formando a carbamino-Hb.
pO2 – 25 a 40 torr
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Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampão.
O próton H+ gerado da dissociação do H2CO3 é tamponado por histidinas que ligam o heme.
Ao receber o próton, a HbO2 sofre o efeito Bohr, que resulta em uma diminuição da afinidade pelo o O2, facilitando a desoxigenação.
Concordando com o efeito Bohr, a Hb oxigenada é mais ácida (pK ~7.4) do que a Hb desoxigenada (pK ~7.6 ).
pO2 – 25 a 40 torr
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Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampão.
No pulmão, a pO2 é de 100 torr e o pH é mais alcalino (pH ~7.6). 
A Hb desoxigenada recebe O2 e libera os prótons H+ recebidos no tecido. O efeito Bohr agora resulta em um aumento da afinidade pelo o O2, facilitando a oxigenação.
Esses fatores fazem a anidrase carbônica catalizar a reação reversa, formando CO2 e H2O a partir de H2CO3, resultante da associação bicarbonato e H+.
pO2 – 100 torr
11. O CO2 ligado à Hb é liberado. 
12. O CO2 difunde para o plasma e daí para os alvéolos.
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O 2,3-bifosfoglicerato (2,3 BPG) é um produto exclusivo do metabolismo das hemácias, formado a partir de um dos intermediário da via glicolítica, por uma enzima mutase específica. 
Vários mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio. 
O 2,3-difosfoglicerato é um regulador alostérico negativo da hemoglobina. 
A ligação de uma molécula de 2,3 BPG à hemoglobina reduz a sua afinidade por O2, facilitando a desoxigenação. 
O 2,3 BPG liga-se na cavidade central do tetrâmero da hemoglobina, estabilizado por interações eletrostáticas com resíduos de carga positiva.
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Na oxihemoglobina, a cavidade central é menor, expulsando o 2,3-DPG e aumentando a afinidade da molécula por O2. 
A mudança conformacional que ocorre na primeira desoxigenação torna essa cavidade maior na desoxi-hemoglobina, possibilitando a ligação do 2,3-DPG. 
A concentração plasmática de 2,3-DPG é constante, ~5 mM.
 Populações que habitam regiões de elevada altitude, onde a atmosfera é rarefeita, apresentam como mecanismo compensatório um aumento nos níveis da enzima mutase que forma o 2,3 BPG.
Com concentrações plasmáticas mais elevadas de 2,3-BPG, e uma consequente diminuição da afinidade da Hb por O2, não há prejuizo da oxigenação dos tecidos, apesar da pO2 atmosférica mais baixa eventualmente não ser suficiente para saturar 100% a Hb.
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A regulação da afinidade da hemoglobina pelo O2 é um somatório do 
efeito Bohr e do 2,3 –bifosfoglicerato, além da cooperatividade positiva.
Stripped Hb – Hb sem nenhum modulador
Whole blood – Hb em sangue total, com todos seus moduladores
A figura ilustra a somatória de efeitos moduladores negativos do 2,3 BPG e do CO2 (efeito Bohr) sobre a afinidade da hemoglobina para o oxigênio.
Observe como a P50 (pressão parcial de O2 que satura 50% das moléculas) aumenta progressivamente a medida que os moduladores são adicionados ao meio.
O efeito Bohr (presença de CO2) e o 2,3-BPG, juntos, diminuem em cerca de 2,6 vezes a afinidade da Hb pelo O2.
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Evolução das globinas
mioglobina
hemoglobina
Na evolução das globinas, houve um evento de duplicação gênica, e depois, divergência de cada um dos genes através de mutações pontuais, que acabaram originando as duas cadeias globínicas da atual hemoglobina.
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Ontogenia das hemoglobinas humanas
A hemoglobina A (HbA), composta das cadeias a e b, corresponde a 96-98 % da hemoglobina total de um adulto.
Um variante normal da hemoglobina A, correspondente a 2-3% da hemoglobina total em adultos, é a HbA2, formada por cadeias a e d (delta), ou seja, a2d2.
No adulto, a Hemoglobina A resulta da expressão co-dominante de 2 genes que codificam a cadeia b e de 4 genes que codificam a cadeia a.
Durante a vida embrionária e fetal, diferentes genes para as globinas são expressos sucessivamente.
Existem 17 genes para globinas no genoma humano.
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Ontogenia das hemoglobinas humanas: 17 genes codificando cadeias globínicas
O gráfico e a tabela mostram a sucessão de diferentes hemoglobinas e a sua composição em cadeias globínicas presentes no embrião, feto (após a 12a. semana) e no adulto. 
Após o nascimento, com a repressão da síntese da cadeia g e aumento da síntese da cadeia b, ocorre a troca da HbF pela HbA, que se completa entre o 3o e 4o mês de vida. Nessa fase são muito importantes os “banhos de luz” dados na criança, pois estes auxiliam na degradação de derivados tóxicos do heme, formados na destruição das hemácias fetais.
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A Hemoglobina Fetal (HbF)	
 A HbF possue cadeias g (gama) equivalentes à cadeia b da HbA, com
10 aminoácidos diferentes nas sequências primárias dessas globinas. 
 Uma das substituições importantes na HbF é a posição 82 da cadeia g, que possui um resíduo de serina (polar sem carga), diferentemente da cadeia b, que tem lisina (Lys82; com carga positiva) nessa posição. 
 Essa substituíção resulta numa ligação mais fraca do 2,3-DPG, que interage com as globinas por interações eletrostáticas, à HbF.
 
 Como resultado, a HbF apresenta maior afinidade por O2 do que a HbA materna, possibilitando a captação de O2 a nível da barreira placentária.
Ligação do 2,3-BPG com a hemoglobina A
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Hemoglobinopatias
 Como existem 4 alelos de cadeia a e 2 de cadeia b expressos co-dominantemente, são conhecidos mais mutantes de cadeia b (produzem 50 % de Hb anômala) do que de cadeia a (produção de 25 % de Hb anômala).
 Hemoglobinopatias podem resultar de mutações nos genes estruturais das globinas, ou ainda nos genes reguladores da síntese das diferentes globinas, que é o caso das talassemias. 
 Mutações pontuais nos genes das globinas a e b são relativamente frequentes. Em outubro de 2003 já eram conhecidos mais de 900 tipos de hemoglobinas anômalas contendo a troca de 1 aminoácido na cadeia a ou na cadeia b.
 Mutações duplas, inserções e deleções são casos mais raros. 
 A figura acima ilustra posições na sequência primária de cadeias a ou b para as quais são conhecidos mutantes pontuais de Hb com alterações na estabilidade e/ou solubilidade da proteína ou na afinidade por oxigênio, que resultam em patologias.
 Observe que a grande maioria dessas posições estão em “cotovelos” da molécula, onde as a-hélices não existem. Mutantes das histidinas proximal e distal (posições 92 e 63 na cadeia b, respectivamente), podem resultar em incapacidade de ligar O2.
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A tabela mostra exemplos de hemoglobinas anormais que são mutantes pontuais.
Hemoglobinas M apresentam substituições nas histidinas proximal ou distal, ou resíduos hidrofóbicos do bolsão do heme. 
 Como resultado, nas HbM ocorre a oxidação do Fe2+a Fe3+, tornando-as incapaz de ligar O2. 
Metahemoglobina é uma HbA normal oxidada a Fe3+, situação que pode ser causada por fumaça de cigarro, cianetos, etc.
Não confundir metahemoglobina com HbM.
Hemoglobina S ou falciforme apresenta uma troca de uma resíduo ácido por um apolar, causando alterações na solubilidade da proteína, que passa a ter tendência de polimerizar. Não há alterações na afinidade pelo O2.
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 * Existem outros variantes de HbG de cadeia a. A HbG Philadelphia é um variante de cadeia a que frequentemente traz deleção dos alelos não afetados. Quando não ocorre deleção, existe ~20% de HbG, com deleção de 1 alelo, ~30% de HbG, e com deleção de 2 alelos, ~40% HbG.
 *** HbD Punjab apresenta o mesmo tipo de mutação.
# Não é uma mutação pontual e sim um porduto de crossover durante a meiose.
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Anemia falciforme e hemoglobina S (HbS)
A HbS apresenta um resíduo
de valina na posição 6 da cadeia b, no lugar do ácido glutâmico presente na HbA. 
Essa troca resulta em alteração da solubilidade da HbS, que apresenta tendência de polimerizar quando desoxigenada, formando fibras que se depositam dentro da hemácia, deformando-a.
Deformadas, essas hemácias são retiradas de circulação, causando o quadro anêmico.
A figura ao lado é uma micrografia de uma fibras de HbS, que se organizam por polimerização de muitas moléculas, conforme o esquema abaixo. 
Fibra de HbS
Hemácia falcêmica
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Hemoglobina S: a valina na posição 6 da cadeia b da HbS faz interação hidrofóbica com 
	resíduos Phe 85 e Leu 88 da cadeia b de outra molécula de HbS, determinando 	polimerização da HbS desoxigenada. 
 	 A polimerização reverte quando a HbS fica 100% saturada. Não há alteração 	da afinidade por O2, ou seja, o efeito Bohr, a ligação do 2,3-BPG e a cooperatividade 	não são afetados.
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 Origem geográfica: região de São Leopoldo, RS, Brasil
 mutação pontual com substituição de Ser por Cys na posicão 9 da cadeia b na região helicoidal A6 
 por conter uma cisteína a mais, a HbPorto Alegre apresenta tendência de polimerizar, fazendo tetrâmeros via pontes –S-S- 
 a polimerização é baixa in vivo, mas intensa em hemácias armazenadas (diminuição do poder redutor)
 veja artigo e texto complementar para mais informações.
A Hemoglobina Porto Alegre
Tetrâmero de HbPA
Microscopia eletrônica de tetrâmeros de HbPa