proteomica bioquimica

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Disciplina: Seminário I
Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira
Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura
Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA
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Abordagem Proteômica e a Identificação de Biomarcadores de Processos Fisiológicos
Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira
Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura
Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA
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INTRODUÇÃO
Proteínas 
Estrutural
Transporte
Enzimática
Hormonal
Imunológica
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INTRODUÇÃO
Anderson & Anderson (1982)
ATLAS DAS PROTEÍNAS HUMANAS
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		A identificação e caracterização de proteínas, constituintes de uma matriz biológica (organismo, célula, organela, fluído biológico) que são produzidas em um determinado momento e sob determinadas condições.
Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995)
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Degradações
Proteínas
DNA
Transcrição
pré-RNAm
Splicing
RNAm
Tradução
Modificações
Fatores epigenéticos
Temperatura
Estresse
Doenças
Alimentação
Dinâmica do proteoma
WITZMANN & LI (2002)
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OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA
Proteômica
Nível de expressão de proteínas
Modificações Pós-traducionais
Interações entre proteínas
Identificação de Biomarcadores
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BIOMARCADORES
		São moléculas biológicas indicadoras de estados fisiológicos ou patológicos, passíveis de serem mensuradas em células e fluídos biológicos.
Moore et al., (2007)
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ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
Amostra
Separação
Identificação
ZHOU et al., (2005)
Coleta
Coleta
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Coleta de amostras:
Unicelulares (+ sincronização):
fase do ciclo celular e condições de cultivo
Células e Tecidos de Organismos Pluricelulares 
(- sincronização):
Biópsias: ≠ tipos celulares 
Cultura de tecidos
Coleta: Manual X microdissecção a laser
Fluídos biológicos
Complexidade
ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
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Eletroforese Bidimensional (2D) 
Espectrometria de Massa (EM)
Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos;
Quantitativos
Qualitativos
Cromatografia líquida (CL)
Espectrometria de massa (EM)
Recuperação de ptns na forma nativa
Análises funcionais, estruturais e bioquímicas
ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
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Separação de misturas proteícas com base em dois parâmetros físico-químicos: ponto isoelétrico (pI) e a massa molecular (M.M.), sob a influência de um campo elétrico:
1ª Etapa: Focalização Isoelétrica
pI
2ª Etapa: Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE)
Tamanho (massa molecular)
O’Farrell, 1975; Gorg et al. 1998
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(+)
(-)
pI
(menor)
M.M.
SDS-PAGE
Focalização Isoelétrica
(maior)
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(menor)
M.M.
SDS-PAGE
(maior)
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(+)
(-)
M.M.
Revelação
 Azul brilhante de Coomassie coloidal
 Fluorescência
pI
(+)
(-)
Análise do gel
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
controle
Tratamento
Gel A
Gel B
≠
ISSAQ & VEENSTRA (2008)
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ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE)
controle
Tratamento
Cy5
Cy5
UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008)
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Tabela 1. Vantagens e limitações da eletroforese bidimensional.
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA
Digestão: tripsina
Espectrômetro de massas
m/z
Espectros de massas
Programas: identificar a proteína
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		Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação (m/z) através de um campo elétrico ou magnético.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Fonte de Ionização
Analisador
Detector
Recipiente com baixa pressão
Amostra
Dados
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ESPECTROMETRIA DE MASSA
Ionização por dessorção a laser assistida por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF)
Tempo de vôo
Detector
Laser
amostra
Karas & Hillkamp (1998)
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ESPECTROMETRIA DE MASSA
m/z
Espectros de massas
peptídeos
Programas de Análise e pesquisa em banco de dados.
Impressão Digital de peptídeos
Proteína
Biomarcador
Espectrômetro de massa
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
		Método de separação física baseado na migração diferencial de compostos, devido a suas distintas interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (bombeada sob pressão) e a fase estacionária (pequenas partículas).
peptídeos
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
Fase líquida:
Solvente: alto grau de pureza
Fase estacionária:
	
Troca iônica
Altamente carregada (íons + ou -)
Exclusão molecular 
Poros com tamanhos controlados
MATT et al. 2008
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SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
Reservatório fase móvel
Bomba de alta pressão
Registro e análise dos dados
Detector
amostra
coletor
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
Métodos de detecção:
Absorbância (UV)
Fluorescência
Espectrometria de massa
CLEM
proteínas
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CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM (ES/ES)
Ionização por spray de elétrons –Tempo de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF)
m/z
Camara de colisão
MATT et al., 2008
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ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM)
m/z
Espectros de massas
Programas de Análise e pesquisa em banco de dados.
Sequenciamento de novo da proteína
Proteína
Biomarcador
Espectrômetro de massa
(EM/EM)
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Tabela 1. Vantagens e limitações da cromatografia líquida de alta performance.
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ABORDAGEM PROTEÔMICA E IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES 
Do geral para o particular
Analisar proteomas de condições distintas e identificar as diferenças
Do particular para o geral
Analisar uma proteína e inferir suas funções no contexto do todo
Separação de proteínas nas amostras
Eletroforese bidimensional
Cromatografia líquida (LC)
fragmentação
Espectrometria de Massas: 
Determinação de massas para identificação
Impressão digital de peptídeos
Sequenciamento de novo
Bioinformática
PROTEINA
MANN et al. 2001
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Identificação da bactenecina no muco cervico-vaginal pela eletroforese-2D em um modelo ovino de trabalho de parto
Indução de parto
Dexametasona
MS/MS
(+) Bactenecina
YOUNG et al. (2007)
0 h
28 h
Trabalho de parto
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Análise proteômica de proteínas hipotalâmicas de linhagens de galinhas de alta e baixa produção de ovos
corte
poedeira
18 semanas
60 semanas
CLAP-MS/MS
Ribonucleoproteína nuclear heterôgenea H3 (HNRPH3) 
KUO et al. (2007)
(HNRPH3) (+) 
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Proteína Osteopontina como biomarcador de fertilidade em bovinos
Alta fertilidade 
Baixa fertilidade 
Purificação
Sequenciamento
identificação
Osteopontina
KILLIAN et al. (1993)
55 kDa; pI = 6,2
AIDA et al. (1999)
GONÇALVES et al. (2008)
sêmen
oócitos
FIV
(+)
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Desafios na Abordagem Proteômica e Identificação Biomarcadores
Otimização dos bancos de dados 
Detecção de proteínas em baixas concentrações;
Automatização das técnicas;
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Perspectivas da abordagem proteômica e identificação de Biomarcadores
Diagnóstico e prognóstico de doenças e animais humanas e animais;
Seleção de animais de produção;
Descoberta de novos princípios da fisiologia celular;
“Metabolômica”;
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Rodrigo V. De Oliveira
oliveirarv@rocketmail.com
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