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ELISA

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Os métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar a concentração de antígenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade, tornaram-se técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas. Entre esses métodos, um dos mais usados é o ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay).
	Nesse método, uma enzima, que reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido, é covalentemente ligada a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo. Se o antígeno estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. Então, a presença de produto colorido indica a presença de antígeno. Trata-se de um método eficiente pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g).
	No ELISA, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior especificidade.
Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUÍCHE. Nesse método, o anticorpo de um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no well. Depois, o antígeno (soro, urina ou outra solução contendo o antígeno) é adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente anticorpo ligado à enzima é adicionado. Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional à quantidade de antígeno presente. Logo, permite mensurar até pequenas quantidades de antígeno.
Quanto ao método de revelação, pode ser direto ou indireto. No primeiro, a enzima reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo, enquanto no indireto, a enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo.
O ELISA constitui a base do teste para infecção por HIV. Nesse teste, proteínas virais (os antígenos) adsorvem nos “poços” (wells) da placa de ELISA. Em seguida, é adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se ligam aos antígenos. Finalmente, anticorpos ligados à enzima ligam-se aos anticorpos humanos, propiciando a reação enzimática com mudança de cor. 
	
	
	
	EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS:
PLACA DE ELISA
PIPETAS AUTOMÁTICAS
LEITOR DE ELISA
LAVADOR AUTOMÁTICO DE PLACAS
		CUIDADOS:
Data de validade e estocagem dos REAGENTES
Processamento e estocagem das AMOSTRAS
Evitar contaminação e espuma no PREPARO DE SOLUÇÕES
CALIBRAÇÃO de pipetas e demais aparelhos
LIMPEZA
	 PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE:	
Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o primeiro anticorpo com concentração conhecida e suficiente para adsorver nos “poços” (“wells”) da placa. Em geral, a solução é saturada.
Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.
Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular, como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de bloquear as áreas onde os anticorpos não aderiram na placa (sítios inespecíficos).
Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAÇÃO da placa está cumprida.
Incubação com as amostras (soluções teste com antígenos em concentração desconhecida devem ser adicionadas à placa)
Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o anticorpo previamente aderido à placa também permanecerá aderido. Por outro lado, os antígenos não ligados serão removidos.
Incubação com segundo anticorpo, seguida de lavagem.
Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a uma enzima, como a peroxidase. Segue-se outra lavagem.
Adição de substrato para revelação. Trata-se de um substrato incolor que, quando ativado pela porção enzimática do ligante, produz um produto final corado. A mudança de cor pode ser lida diretamente em aparelho apropriado. Em geral, bloqueia-se a reação para evitar que o produto final fique muito escuro e atrapalhe a leitura do teste. Além de bloquear a reação, é possível adicionar um ácido que provoque mudança para uma cor cuja absorbância é melhor detectada pelo leitor de ELISA.
	 OBSERVAÇÕES IMPORTANTES
Em geral, faz-se uma CURVA PADRÃO, preenchendo 8 “poços” de uma fileira com concentrações crescentes e conhecidas de antígeno. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-testes. O gráfico é fornecido por um programa próprio para a leitura de ELISA.
Um outro controle feito é o TESTE BRANCO, que consiste na adição somente do tampão com o objetivo de avaliar se houve contaminação durante o experimento.
O teste deve ser feito em DUPLICATA ou TRIPLICATA, servindo de controle para os erros de manuseio. A média dos resultados deve ser avaliada e se houver diferença significativa, o experimento deve ser repetido.
PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: se a amostra for sangue, deve-se centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir e analisar. Células em cultura devem ser trituradas, o tampão deve ter pH adequado, substância detergente(para lisar a membrana) e inibidores de proteases. Depois, centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para análise.
http://www.callisto.si.usherb.ca:8080/iml302/images/elisa3.jpg
http://www.jaelsa.com/imagenes/pipeta1.jpg
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http://pandora.labgeminis.com:8909/images/8x200_ul.jpg
http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnica_elisa.htm
Leitor de tiras ELISA
Leitor de placas ELISA
http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnica_elisa.htm
EXEMPLO DE CURVA PADRÃO
http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm
http://www.iitri.org/ServImmunology.shtml
http://www.positivehealth.com/permit/Articles/Colon%20Health/abraham62.htm
http://www.netria.co.uk/images/elisa2.jpg
ANTICORPO
LIGADO
2O ANTICORPO
ANTÍGENO DA AMOSTRA
1O ANTICORPO
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162.]
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162.]
MUDANÇA DE COR
ADAPTADO DE: http://www.med4you.at/laborbefunde/techniken/enzyme/eliza.gif

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