Aula_Tecnicas_BioMol_2012

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Técnicas de 
Biologia 
Molecular 
Digestão de DNA com 
enzimas de restrição e 
eletroforese em gel de 
agarose 
2 
1971 – descoberta das enzimas de 
restrição 
Werner Arber (Nobel de 1978) no Brasil em 2011 
Enzimas de Restrição 
Classes of Restriction Enzymes
Type I
cleavage occurs 400-7000 bp
from recognition site
Type II
cleavage occurs adjacent or
within recognition site
Type III
cleavage occurs 25-27 bp
from recognition site
• Endonucleases sítio-específicas isoladas de 
procariotos 
• Protegem a bactéria do ataque de vírus 
• Protegem seu próprio DNA metilando-o no sítio 
de restrição 
• Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em 
Biologia Molecular 
EcoRI metilase 
3 
Características dos sítios de restrição 
• Tipicamente, são sequências 
palindrômicas de 4-8 bp 
 
• Algumas enzimas toleram alguma 
degeneração no sítio 
 
• Clivagem produz extremidades 
5’-PO4 e 3’-OH 
 
Extremidades Geradas 
 
Bam HI 
Kpn I 
Sma I 
5’-salientes 
3’-salientes 
Abruptas (cegas) 
4 
 
 
Frequência de corte no sítio 
de restrição 
• Sítios estão espalhados randomicamente no genoma 
 
• Número estimado depende da composição de bases: 
 
• Para genoma com conteúdo de 50% GC: 
 G A A T T C 
 (¼) (¼) (¼) (¼) (¼) (¼) = 1/4096 
 
• Se o genoma for de 4 x 106 pb, então haverá 1000 sítios 
 
• Distribuição randômica implica na geração de fragmentos de 
diversos tamanhos 
Eletroforese 
5 
Eletroforese em gel 
• Ácidos nucleicos têm carga global 
negativa (PO4
-) 
 
• Gel de agarose ou poliacrilamida 
 
• Migração inversamente proporcional 
ao tamanho 
 
• Influência da topologia 
• linear vs. circular 
• Fita dupla vs. fita simples 
 
acrilamida 
6 
Eletroforese de 
gel de agarose 
 
• Aplicar voltagem constante 
• Detectar com corante fluorescente 
(brometo de etídeo, SYBR, etc) 
7 
Cálculo do tamanho 
de fragmentos 
2.5 
3.0 
3.5 
4.0 
4.5 
0.2 0.4 0.6 0.8 1 
Mobilidade (cm) 
lo
g
(b
p
) 
• Plotar mobilidade relativa vs 
 log [tamanho] em pb 
• Melhor usar dsDNA linear 
8 
Digestão DNA Linear X Digestão DNA Circular 
Digestão (2 sítios de restrição) 
Digestão de DNAs com múltiplos sítios 
de restrição 
9 
Mapas de restrição 
Mapas de restrição 
10 
Pulse Field Gel 
Electrophoresis (PFGE) 
Configuração de eletrodos do aparato CHEF 
(contoured-clamp homogeneous electric field) 
Técnicas de Hibridização 
11 
• As fitas de DNA podem ser separadas em condições que 
quebram as ligações de hidrogênio 
 
• Fitas duplas (duplexes) podem se formar in vitro 
 
• Formação dos duplexes depende da complementaridade 
das sequências 
 
• Sondas homólogas (fita simples) podem ser usadas para 
detectar ácidos nucleicos específicos 
calor 
Técnicas 
1) Southern Blot: deteção de DNA: sonda é DNA 
ou RNA marcado. 
 
2) Northern Blot: deteção de RNA: sonda é DNA 
ou RNA marcado. 
12 
Hibridização de ácidos nucleicos 
Southern Blot 
• Descrito pelo Dr. Southern (1975) 
• Digestão do DNA seguido de eletroforese 
• Transferência para membrana (imobilização) 
• Detecção com sonda (radioativa ou não) 
 
Northern Blot 
• Eletroforese de RNA 
 
 Exemplos de sondas 
 
• Fragmentos de DNA 
clonados 
• Oligonucleotídeos sintéticos 
• RNA (riboprobes) 
Northern e Southern Blot 
Northern blot 
Southern blot 
13 
Transferência do DNA/RNA para 
membrana 
• Ação capilar 
Hibridização 
• A sonda é desnaturada (DNA) por calor, 
adicionada à membrana e incuba-se o 
sistema por um tempo suficiente para 
permitir a interação 
 
• No caso do Southern e Northern Blot, a 
temperatura de incubação é um 
parâmetro essencial 
14 
“Melting Temperature” (Tm) e Estringência 
Melting Temperature (Tm) 
• temperatura em que 50% das fitas estão separação 
 
Estringência 
• Refere-se às condições experimentais que favorecem a 
hibridização (temperatura de incubação e concentração 
de sais) 
 
• Reflete a homologia entre a sonda e o alvo 
alta Tm-15
ºC 
moderada Tm-25
ºC 
baixa Tm-35
ºC 
Detecção dos híbrido 
sonda-molécula alvo 
• Autorradiografia: exposição da membrana a um 
filme de raios X (se a sonda for radioativa) 
 
• Detecção de atividade enzimática: sondas não-
radioativas marcadas com enzimas. Incubação 
com substrato que pode gerar luz ou um 
preciptado colorido 
15 
Autorradiografia: exposição da membrana a 
um filme de raios X 
 
 
Resumo 
16 
Marcação radioativa de 
sondas de DNA 
•Nick translation 
 
•Random priming 
 
 
Nick translation 
Target dsDNA
The first nucleotide on the 5Õ-P side
of nick has been removed
A nick with a 3Õ-OH terminus has been
introduced by Dnase I into the DNA duplex
A nucleotide has been inserted to replace
the one removed. The nick has been translated
one position along the chain in a 5Õ to 3Õ direction.
The nick has now translated 4 positions along
the DNA chain. The process continues
The 5-3 exonuclease and the
5-3 polymerase plus
dNTP's one of which is labelled
Digestão branda com 
DNAseI produz cortes 
(nicks) 
Ação Exo 5´ 3´ e Polimerásica 
5´ 3´da DNA Pol I na 
presença de dNTP sendo um 
deles radioativo 
17 
Klenow = DNA Pol. I sem atividade 
 Exo 5
 
→3
 
 
Random Priming 
 
• usar [32P]dNTP 
Aplicações das Técnicas de 
Hibridização 
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Aplicações 
• Teste de paternidade/maternidade 
 
• Identificação criminal (forense) 
 
• Diagnóstico de doenças genéticas 
“Fingerprinting” genético 
• Uso de sonda de DNA repetitivo 
produz uma padrão complexo 
de bandas no Southern Blot 
 
• Distinção de espécies, cepas, 
indivíduos, etc 
 
• Pode ser usado no diagnóstico, 
taxonomia e análises forenses 
Isolados de M. tuberculosis 
19 
Identificação forense: o caso da 
família Romanov 
 
 Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. 
Nature Genetics 6, 130 - 135 (1994) 
 
20 
Teste de Paternidade 
Teste de Paternidade 
MOM = Mãe 
DAD = Pai 
D1 e S1 = Filha e Filho de MOM e DAD 
D2 = Filha do primeiro casamento de MOM 
S2 = Filho adotivo 
21 
RFLP 
Restriction 
Fragment 
Length 
Polymorphisms 
• Ganho ou perda de sítios de 
restrição produzem fragmentos de 
DNA de diferentes tamanhos para 
análise por Southern blot 
 
• Também é sensível a eventos de 
inserção e deleçãos 
 
• Polimorfismos não precisam estar 
relacionados com o locus genético 
da sonda 
 Diagnóstico de doenças genéticas por RFLP 
22 
Sequenciamento de DNA 
Estratégias de Sequenciamento 
Método de Maxim & Gilbert: técnica química (em 
desuso) 
 
Método de Sanger (1977): Reação de Terminação da 
Cadeia (técnica enzimática) 
 
 
Pré-requisitos: 
 DNA polimerase, magnésio 
 primer 
 dNTPs (substrato) 
 ddNTPs (análogos dos dNTPs) 
23 
Reação da DNA Polimerase 
Dideoxirribonucleotídeo 
24 
 O 
 | 5 ’ 
O = P - CH2 
 | 
 O 
o 
3’ 2’ 
 
 
H 
H 
BASE 
 O 
 | 5’ 
O = P - CH2 
 | 
 O H 
o 
3 ’ 
 
H 
2’ 
 
 
H 
H 
BASE 
Fim de Cadeia 
 H 
primer 
template 
DNA pol 
dNTP 
3´ 5´ 
3´ 5´ 
A Reação de Sequenciamento 
25 
+ dNTP radioativo 
26 
Principais aperfeiçoamentos 
da técnica 
• Introdução de 
instrumentos de 
sequenciamento 
baseados em 
capilares e leitura 
ótica a laser da 
fluorescência 96 amostras em paralelo 
AUTOMAÇÃO27 
Sequenciamento 
automático de DNA 
 
• ddNTPs ligados a uma molécula 
fluorescente  todos os fragmentos 
terminando em um ddNTP específico 
apresentam uma cor particular 
• todos os 4 ddNTPs marcados em um 
único tubo 
• separação dos fragmentos em capilar 
• feixe de luz lazer 
• sequência de DNA  sequência de 
cores 
Principais aperfeiçoamentos 
da técnica 
• Desenvolvimento da 
bioinformática, com 
sistemas de softwares 
para interpretação dos 
dados gerados e 
montagem das 
sequências. 
28 
Pirosequenciamento 
Pirosequenciamento 
29 
Reação em Cadeia da Polimerase 
Polymerase Chain Reaction 
(PCR) 
Técnicas de Hibridização: Limitações 
 
 
 
 
• requerem muito DNA ( g) 
 
• DNA tem que estar bem puro 
 
• tempo do ensaio: até uma semana 
30 
Polymerase Chain Reaction (PCR) 
• Fragmentos específicos de DNA são 
enzimaticamente amplificados 
 
- Amplificação de até 106 X é possível! 
- Pode detectar até 1 molécula! 
 
•Tolera DNA relativamente impuro 
•Tempo: menos de 1 dia ! 
Kary Mullis (1985) 
 
31 
PCR 
 
O que é necessário?? 
 
 Termociclador 
 
 DNA Molde (template) 
 Primers 
 dNTPs 
 DNA Polimerase 
 Mg2+ 
Taq Polimerase 
 
• DNA polimerase de Thermus aquaticus: 
organismo termofílico 
 
• Enzima resiste a altas temperaturas 
 
• Temp. ótima: 72-74ºC 
32 
Princípio da Técnica 
Reação de Replicação in vitro 
 
 1. Desnaturação: 94
 
C 
 
 2. Anelamento (Tm): 45
 
C - 60
 
C 
 
 3. Polimerização: 72
 
C 
Cálculo do Tm: 
 
Tm = 2(A + T) + 4(G + C) 
Desnaturação do template 
95
 
C 
Anelamento dos primers 
45-65
 
C 
Extensão pela polimerase 
72
 
C 
33 
34 
Algumas aplicações clínicas do 
PCR 
 
– Clonagem de genes 
– Screening de genes mutantes 
– Determinação de sexo pré-natal 
– Diagnóstico de doenças genéticas 
– Detecção de infecções 
– Monitoração de terapia contra o câncer 
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Três regiões 
amplificadas para 
gerar um “DNA 
fingerprint” 
Identificação 
36 
Aplicações não-clínicas 
– Sequenciamento de DNA 
– Screening de clones 
– Estudos de ecologia e evolução molecular 
– Identificação de organismos transgênicos 
– Fingerprinting forense