Enzimas: Proteínas Catalisadoras

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ENZIMAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
Profa. Dra. IZA MARINEVES ALMEIDA DA ROCHA
organismo
ENZIMAS
Sacarose + O2  Co2 + H2O
ENERGIA
PENSAR, MOVER, SENTIR, VER, ETC.
Processo termodinamicamente favorável, no entanto, 
MUITO LENTO!!!
SACAROSE
ENZIMAS
Condições fundamentais para vida:
Capacidade de auto-replicação;
Proteínas mais especializadas;
Eficiência catalítica extraordinária e seletiva;
Alto grau de especificidade por seus substratos;
Trabalham em soluções aquosas sob condições suaves de temperatura e pH.
Importância de se estudar as enzimas:
 Desordens catalíticas (doenças);
 Diagnóstico de doenças;
 Efeitos de drogas;
 Indústria química;
 Indústria de alimentos;
 Indústria agronômica; etc.
Histórico:
Estudos da digestão da carne por secreções do estômago, 1700;
Conversão do amido em açúcares simples pela saliva e por extratos vegetais, 1800;
Fermentação do açúcar em álcool por leveduras, Louis Pasteur, 1850; - “fermentos inseparáveis” de células vivas.
Modelo “chave-fechadura”, Emil Ficher, 1894; 
 Extratos de levedura podiam fermentar o açúcar, Eduard Buchner, 1897;
Histórico:
(6) Extratos de levedura podiam fermentar o açúcar, Eduard Buchner, 1897;
(7) Cristalização da urease, James Summer, 1926, postulou que todas as enzimas eram proteínas;
(8) Cristalização da tripsina, pepsina, e outras enzimas digestiva, John Northrop e Moses Kunitz, 1930;
Histórico:
(9) Tratado “Enzimas”, J.B.S. Haldane – sugeriu que as interações fracas que se estabelecem entre a enzima e seu substrato poderiam ser usadas para distorcer a molécula de substrato e catalisar a reação;
(10) A fim de catalisar reações a enzima deve ser complementar ao estado de transição, Linus Pauling, 1946.
Características das Enzimas
A maioria das enzimas são proteínas, com exceção de algumas moléculas de RNA com poder catalítico (Ribozimas);
Geralmente são proteínas de alta massa molecular;
A atividade catalítica das enzimas depende da integridade da estrutura protéica, ou seja, da conformação da proteína nativa:
Quando há perda da estrutura terciária e quaternária da proteína (desnaturação), a atividade enzimática normalmente é perdida;
2. Quando há a quebra da enzima em seus aminoácidos constituintes, perde-se a atividade enzimática.
Características das Enzimas
Algumas enzimas, além de seus resíduos de aminoácidos, necessitam de um grupo químico adicional. Esse grupo é chamado de cofator, e ele é necessário à atividade enzimática;
O cofator pode ser um ou mais íons inorgânicos como: Fe2+, Mg2+, Mn2+ ou Zn2+.
Algumas enzimas necessitam de moléculas orgânicas e metalorgânicas mais complexas, que são chamadas de Coenzimas;
Grupos Prostéticos: Quando uma Coenzima ou 1 ou mais íons metálicos estão covalentemente ligados a enzima;
Holoenzima: Uma enzima cataliticamente ativa e completa, tanto com sua Coenzima e/ou Cofatores;
Apoenzima ou apoproteína: A parte exclusivamente protéica das enzimas.
Classificação das Enzimas
As enzimas são classificadas de acordo com a reação que catalisam;
Cada enzima possui um número E.C. e um nome sistemático;
Por Exemplo:
ATP + D-Glicose ↔ ADP + D-Glicose-6-fofasto
Nome Sistemático: ATP: glicose fosfotransferase
Número E.C.: 2.7.1.1 Nome Trivial: Hexoquinase
 2  Transferase
 7  Fosfotransferase
 1  Fosfotransferase com grupo OH- como aceptor
 1  D-Glicose como grupo aceptor de fosfato 
Modo de Ação das Enzimas
Muitas das reações químicas celulares, mesmo sendo termodinâmicamente favoráveis são improváveis de acontecer nos seres vivos, pois são extremamente lentas;
É Necessário a Formação de Eventos Químicos favoráveis:
1. Formação Transiente de Intermediários de reação;
2. Colisão de duas ou mais moléculas na orientação precisa requerida pela reação;
3. Rearranjos de ligações químicas, etc.
As reações ocorrem no Sítio Ativo da Enzima: local na proteína onde vai acontecer a catálise. Nesta região a catálise é energeticamente favorável.
A molécula que sofrerá a reação por parte da enzima e se ligará ao sítio ativo é chamada de Substrato;
A formação do Complexo Enzima-Substrato é central para a ação das Enzimas;
E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P
E  Enzima ES  Complexo Enzima-Substrato
S  Substrato 
P  Produto 			EP  Complexo Enzima-Produto
Funcionamento das Enzimas
Aumentam a velocidade da Reação no entanto, não afetam o Equilíbrio da Reação.
Estado Basal dos Produtos e Reagentes
1.Há uma barreira energética entre o substrato e o produto que representa a energia necessária para os alinhamentos dos grupos reagentes, formação de cargas transientes instáveis, rearranjo de ligações químicas e transformações necessárias para a ocorrência da reação.
2.Para sofrer a reação, as moléculas devem superar esta barreira e serem elevadas para um nível mais alto de energia;
Este nível mais alto de energia é o chamado Estado de Transição: não é um intermediário de reação e não significa estabilidade de alguma espécie química.
Funcionamento das Enzimas
A diferença entre os níveis de energia no estado basal e o estado de transição é chamada de Energia de Ativação;
Relação entre a Energia de Ativação e a Velocidade de Reação:
1.Quanto maior a Energia de Ativação, mais lenta é a reação.
2.A adição de um catalisador aumenta a velocidade de reação, pois diminui a Energia de Ativação.
3.O Equilíbrio da Reação, não é afetado:
Uma enzima que catalisa a reação S  P, catalisa a reação PS;
A enzima não é utilizada no processo, portanto, o ponto de equilíbrio não é afetado;
No entanto, este equilíbrio será alcançado muito mais rapidamente.
Reação: C6H12O6 ↔ 6 CO2 + 12 H2O
Intermediários de Reação  Ocupam vales no diagrama da ação de uma enzima;
Etapa com a energia de ativação mais alta  Etapa Limitante
Poder Catalítico e Especificidade das Enzimas
Reações químicas entre o substrato e os grupos funcionais das enzimas;
1. Os grupos funcionais catalíticos das enzimas (grupos R de resíduos aa, íons metálicos e coenzimas) podem interagir transitoriamente com um substrato e ativá-lo para a reação;
2. A força catalítica das enzimas é derivada da energia livre liberada na formação das múltiplas ligações fracas e interações que ocorrem entre a enzima e o substrato. Esta energia de ligação é responsável tanto pela especificidade como a catálise;
3. As interações fracas atingem o estado ótimo no estado de transição da reação; as enzimas são complementares aos estados de transição das reações que elas catalisam. 
4. A necessidade de múltiplas interações fracas para efetuar a catálise é uma das razões do por que as enzimas e algumas coenzimas são moléculas tão grandes.
Interação Enzima-Substrato:
Modelo Chave-Fechadura;
2. Enzima Complementar ao estado de Transição
J. B. S. Haldane, 1930;
Linus Pauling, 1946
Cinética Enzimática
Definição:
Estudo das velocidades de reação e como estas respondem a mudanças nos parâmetros experimentais
Abordagem de estudo mais antiga, no entanto, ainda muito utilizada;
Importância do Estudo de Cinética Enzimática:
1.Entendimento dos Mecanismos Enzimáticos;
2.Melhor entendimento das reações químicas no metabolismo;
3.Aumentar a velocidade e o rendimento de reações enzimáticas realizadas in vitro.
Conceitos Básicos
Um dos principais fatores que afetam a velocidade de uma reação catalisada é a [S];
Ao longo de uma reação, a [S] muda durante o curso da reação (a medida que o substrato é convertido em produto);
V0  Velocidade inicial da reação  [S] > [Enzima]
No início, V0 aumenta quase que linearmente com o aumento da [S];
Vmáx  Quando a velocidade não se altera, mesmo com aumento na [S];
Complexo Enzima-Substrato
A Vmáx é observada quando toda a
enzima presente está na forma do Complexo E-S  Enzima Saturada.
A Equação de Michaelis-Mentem
Relação Quantitativa entre a Velocidade Inicial (V0), a velocidade máxima inicial (Vmáx), a concentração inicial de substrato ([S]) e a constante de Michaelis-Mentem (Km);
Quando V0 = ½ Vmáx     Km = [S]
Km é equivalente a concentração de substrato na qual V0 é metade da Vmáx
EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEM
As enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de V0 na [S], diz-se que estas enzimas possuem Cinética de Michaelis-Mentem;
Km e Vmáx podem ser obtidos experimentalmente, mas não fornecem informações sobre o número, velocidade e natureza química de cada etapa na reação.
CURVA HIPERBÓLICA
Gráfico duplo-recíproco Lineweaver-Burk:
Rearranjando a equação de Michaelis-Mentem, podemos obter:
Essa equação é de uma reta, no formato ax +b. Facilita os cálculos do Km e da Vmáx.
E + S  ES  EP  E + P
A maior parte do poder catalítico das enzimas é derivada da energia liberada na formação das múltiplas ligações fracas e interações entre a enzima e substrato. Esta ligação contribui tanto para catálise como para especificidade;
As interações fracas são otimizadas no estado de transição da reação. Os centros ativos são complementares aos estado de transição pelos quais os substratos passam à medida que são transformados em produtos durante as reações enzimáticas.
O termo km é muitas vezes empregado (inadequadamente) como uma indicação da afinidade;
O significado real de km depende de aspectos específicos do mecanismo de reação, tais como o número e velocidades relativas dos passos individuais da reação.
(a) Complexo ternário com associação ao acaso de S1 e S2;
(b) O S1 pode transferir um grupo funcional para enzima (modificando covalentemente E’), que é subseqüentemente transferida para S2. Esse mecanismo é chamado de pingue-pongue ou de dupla-troca.
Fatores que afetam a Velocidade de Reação
1.Concentração do substrato
Velocidade máxima (Vmáx)  Todos os sítios de ligação da enzima estão saturados pelo substrato;
Alguns Fatores que afetam a Velocidade de Reação
1.Temperatura 
2.pH - A estrutura da molécula de proteína cataliticamente ativa depende do caráter iônico das cadeias laterais.
3. Agentes desnaturantes: solventes orgânicos, uréia, etc.
4. Mecanicamente.
Desnaturação:
Reversível
Inrreversível.
Inibição Enzimática
Importante no entendimento dos mecanismos enzimáticos e de rotas metabólicas sendo os inibidores enzimáticos são muito utilizados como agentes farmacêuticos.
Inibidores:
1.Reversíveis: ao se desligarem da enzima, a atividade enzimática é restaurada;
2.Irreversíveis: se combinam ou destroem grupos na enzima que são essenciais a sua atividade - Inibidores Suicidas
Tipos de Inibição:
1.Inibição Competitiva:
O inibidor compete com o substrato pelo sítio ativo da enzima; 
A reação não ocorre uma vez o inibidor esteja ligado a enzima;
Tipos de Inibição:
2.Inibição Não-Competitiva:
O inibidor se liga em um sítio na enzima diferente do sítio aonde irá se ligar o substrato. A ligação do inibidor não impede a ligação do substrato. No entanto, enquanto o inibidor estiver ligado, a enzima está inativada;
Tipos de Inibição:
3.Inibição Mista:
O inibidor se liga em sítio distinto do sítio do substrato. No entanto, o inibidor pode se ligar tanto na Enzima livre como no Complexo E-S.
Enzimas Reguladoras
Enzimas que catalisam o passo limitante na maioria das vias metabólicas;
Elas exibem atividade aumentada ou diminuída em resposta a certos tipos de sinais;
É devido a este tipo de enzima que cada seqüência metabólica é constantemente ajustada para se adequar a demanda celular.
São divididas em duas classes:
1.Enzimas Alostéricas;
2.Enzimas reguladas por modificação covalente reversível.
Efeitos de um modulador + e outro – sobre uma enzima alostérica, onde o Km é alterado
Enzimas Alostéricas
Funcionam através da ligação não-reversível de um metabólito regulatório, chamado de modulador;
Inibição por Feedback (Retroalimentação);
Não seguem a cinética de Michaelis-Mentem.
Inibição por retroalimentação (feedback);
(b) Enzimas alostéricas homotrópicas – onde o sítio ativo pode funcionar também como sítio regulador e o substrato pode ser um modulador +;
(c) Enzimas alostéricas heterotrópicas – o modulador é um metabólito diferente do substrato que podem se ligar a sítios distintos do substrato.
Algumas enzimas reguladoras sofrem modificações covalentes reversíveis
Algumas tipos de regulação requerem a proteólise de um precursor enzimático
(Zimogênios = Precursores inativos = proprotéinas ou proenzimas)
Ativação de zimogênios por clivagem proteolítica, onde é exposto o sítio ativo da enzima
Esse tipo de ativação é irreversível e outros mecanismos são necessários para inativar essas enzimas (proteínas inibidoras que ligam-se fortemente ao sítio ativo);
 Inibidor de tripsina pancreática – sua insuficiência que pode ser causada pela exposição à fumaça de cigarro tem sido associada a lesão no pulmão.