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Profª Ludmilla Rangel » 1957 » Cresceram E. coli em meio com N-15 e depois voltaram pra N-14 » Purificação do DNA das bactérias » Três tipos de DNA ˃ N-15 + N-15 ˃ N-15 + N-14 ˃ N-14 + N-14 » Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava claro que uma fita continha N-15 e outra N-14 » Locais com um contexto de sequência específico » Ligam proteínas específicas » Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação » DNA Polimerase III » Sentido 5’ → 3’ » Nucleotídeos 3P são adicionados ATP, GTP, CTP, TTP ˃ Liberação de Pirofosfato PPi http://207.207.4.198/pub/flash/24/ menu.swf » Ribonucleoproteína » Liga-se à helicase em procariotos formando o chamado primossomo » Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH » DNA polimerase lenta e sujeita a erros » Evita a progressão da forquilha uma vez que a fita líder anda mais rápido Forquilhas de replicação » Fita líder ˃ Primase age uma vez » Fita retardada ˃ Primase age várias vezes ˃ 1967, Fragmentos de Okasaki Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967 Jun;20(3): 255-60 » Retirada das histonas » Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs) » DNA helicase ˃ Quebra pontes de H » DNA topoisomerases ˃ Tiram a tensão Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua) » Enzimas que catalisa a reação de síntese do DNA » Adiciona nucleotídeos tri- fosfato à extremidades 3’OH livre » Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’) » Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre) » Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’>5’) » DNA polimerase I ˃ Descoberta em 1956 (Kornberg pai) ˃ Função precisa descoberta apenas em 1969: remove o primer de RNA da fita descontínua » DNA polimerase III ˃ Descoberta em 1970 (Kornberg filho) ˃ Principal enzima que realiza a replicação em procariotos » DNA polimerase II ˃ Lenta, envolvida em reparo do DNA » DNA Pol precisa de um molde inicial » Primase: gera um molde de RNA complementar » A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH Eliminação dos fragmento s de Okasaki DNA Pol I Visão geral Repare na posição do primer de RNA » Mecanismo de verificação (Proof-reading) » DNA-polimerase possui ˃ Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ ˃ Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ Reparo pela Polimerase • Mecanismo de verificação (Proof-reading) • DNA-polimerase possui – Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ – Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ » Checagem de pareamento incorreto (eucariotos) » Proteínas especiais para reparo do erro » Ataxia de Friedreich's ˃ dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares, na fala e doenças no coração) ˃ forma mais comum das ataxias herdadas ˃ A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40 repetições, o indivíduo apresenta a doença. » Xeroderma pigmentosum ˃ envelhecimento precoce ˃ aumento na incidência de câncer ˃ Falha no mecanismo de reparação do DNA causado pela luz UV » A replicação do DNA é regulada temporalmente » Fase S do ciclo celular » Checkpoints do ciclo celular » Ciclinas » Replicação semi-conservativa » Bolha de replicação avança em duas direções » Fita líder e fita retardada » Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA » Primase faz o primer » DNA polimerase III, DNA polimerase I » DNA ligase » Telomerase
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