RELATÓRIO SOBRE EXTRAÇÃO DE DNA DE TOMATE.docx

Prévia do material em texto

QUÍMICA GERAL (QFL0137)
RELATÓRIO DA EXPERIÊNCIA 2:
EXTRAÇÃO DE DNA DE TOMATE
Arthur Y. Koketsu (10353688) 
Luciano M. B. Santos (5126503)
Robson de oliveira (10321779)
Professor: Pedro Vidinha
31/03/2017
RESUMO
	No experimento em questão, o principal objetivo era aplicar as técnicas laboratoriais, já adquiridas na aula anterior, no processo de extração do DNA (ácido desoxirribonucleico) de um tomate. Inicialmente, preparamos o tomate para a extração por meio da maceração e o aquecemos em banho-maria. Tivemos que manter o banho a uma temperatura determinada e acrescentamos uma solução contendo uma mistura de sais e detergente. 
	Em seguida foi feita a filtração do substrato, com pressão reduzida, para separar os resíduos sólidos do tomate e a substância desejada. Por fim, com auxílio de um solvente orgânico, foi possível isolar e, após certo tempo, visualizar o DNA do tomate. 	Com esse experimento, não apenas aplicamos todos os conhecimentos adquiridos anteriormente, como também aprendemos um procedimento para extração do material genético.
INTRODUÇÃO
	O DNA (do inglês DesoxirriboNucleic Acid) é formado por um conjunto de moléculas que determinam as características de cada ser vivo e é vital por armazenar as informações necessárias para a confecção proteica. Seu modelo, proposto em 1953 por James Watson e Francis Crick, lembra uma escada retorcida, a famosa dupla-hélice. Devido à sua importância, principalmente nas variadas aplicações da Biologia Molecular como PCR, digestão com enzimas de restrição, análises clínicas, forenses, etc [1], é fundamental conhecer e dominar as técnicas para extrair o DNA das células. [2] Nesta experiência, aprendemos uma dessas técnicas.
Figura 1 Desenho esquemático de uma molécula de DNA.[1: Retirado de http://liderbiologia.blogspot.com.br/2012/02/acidos-nucleicos.html]
	A melhor técnica utilizada para extração do DNA depende essencialmente do tipo celular. Se de origem animal ou vegetal. Os procedimentos em geral envolvem:
a lise ou ruptura da célula;
remoção lipídica;
desnaturação proteica;
precipitação do DNA.
	O método mais apropriado deve levar em conta fatores tais como quantidade e tipo de amostra disponível, o grau de pureza desejado e, obviamente, para que finalidade se deseja extrair o DNA. [3]
EXTRAÇÃO ORGÂNICA
	Trata-se de um dos modos de extração do DNA mais comuns. Consiste na ruptura celular e consequente separação através de centrifugação. Há então, a desnaturação das proteínas com algumas proteinases e sua remoção com solventes orgânicos tais como fenol e clorofórmio. Em presença de íons Na+ a baixas temperaturas, por exemplo, o uso de álcool ou isopropanol precipita o DNA. Além do uso de solventes orgânicos perigosos e do tempo para sua aplicação, este método tem o inconveniente de apresentar fenol ou clorofórmio no DNA; o que pode ser um problema dependendo de sua finalidade. [1][2: Proteinases, peptidases, proteases ou enzimas proteolíticas são enzimas que quebram as ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas.]
TECNOLOGIA BASEADA EM SÍLICA
	Este método baseia-se no fato de que o DNA adsorve às membranas de sílica em condições particulares de pH e em presença de sais. Após esta etapa inicial, há a lavagem dos restos celulares e o DNA é eluído em um tampão com baixa concentração de sal. Trata-se de um método mais rápido e rentável que a extração orgânica. [3: Adsorção significa "adesão" à superfície.][4: Solução-tampão é uma solução que contém um ácido fraco com o sal desse ácido ou uma base fraca com o sal dessa base e seu objetivo é evitar que o pH varie.]
SEPARAÇÃO MAGNÉTICA
	Este método tem por princípio a ligação do DNA com superfícies magnéticas. Há, em seguida, a lavagem dos contaminantes e a eluição do DNA com etanol. Este é um método rápido, automatizável, mas que pode ser dispendioso se comparado à extração orgânica e à tecnologia baseada em sílica.
TECNOLOGIA DE TROCA IÔNICA
	Trata-se de um método baseado na interação entre os fosfatos com carga negativa do DNA e as moléculas com carga positiva na superfície do substrato. Tal ligação se dá em baixas concentrações de sal. Há remoção dos contaminantes através de lavagem com tampões de baixa concentração de sal e posterior eluição do DNA com tampões de alta concentração salina. 
	As células de plantas apresentam características distintas das animais. O seu conteúdo bioquímico por exemplo não é o mesmo. Deste modo, os métodos usados para extração de células animais não são aplicáveis às células vegetais. Por exemplo, o fenol utilizado na primeira técnica apresentada anteriormente não serve para remover os polissacarídeos e polifenóis das células vegetais.
MÉTODO CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide)
	O CTAB é um detergente utilizado para formar um complexo insolúvel com o ácido nucleico e precipitar o DNA separando-o de outros componentes da célula como carboidratos e proteínas. A adição de um sal como o NaCl é importante tanto para a atuação do brometo quanto para permitir a precipitação do DNA em presença de um álcool. Uma alternativa ao CTAB é o SDS (Sodium Dodecy Sulfate). [4], [5]
MÉTODO TIOCINATO DE GUANIDINA (GITC)
	O tiocinato de guanidina age na desnaturação de proteínas. Deste modo, seu efeito é a liberação do DNA que se liga às partículas de sílica do composto o que já separa o material genético de outras substâncias. [4]
	Em geral, o método CTAB é utilizado com determinadas variações e adaptações ao tipo de extração que se deseja fazer. [6] Por exemplo, pode ser utilizado PVP (Polivinilpirrolidona) para remover os polifenóis e alta concentração de sal para remoção dos polissacarídeos. Estes resíduos contaminantes presentes no DNA podem prejudicar os procedimentos a que este se destina. No caso, p. ex., de um tratamento PCR (Polymerase Chain Reaction). [5] O RNA pode ser separado com uma RNase. [1]
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparação
	Nesse primeiro processo foi utilizado foram utilizados tripé, bico de Bunsen e tela de amianto para preparação do banho-maria. Em seguido introduziu-se um termômetro submerso no béquer em aquecimento, acoplado com auxílio de uma garra e suporte. Também foi necessário preparar o tomate para a extração por meio de retirada de sua camada superficial e sementes, além de maceração em um almofariz.
Extração
	 Para preparar uma solução capaz de realizar a desnaturação das células vegetais, foram utilizados 2,217 g de citrato de sódio e 0,439 g de cloreto de sódio em um béquer de 250 ml. Após a total dissolução dos sais em 50 ml de água destilada, foram adicionados 10 ml de detergente cujo principal componente químico é um sulfonato de sódio. Em seguida adicionou-se tomate no béquer e o volume foi completado até aproximadamente o dobro do ocupado pelo tomate. Nas pesagens foi utilizada uma balança semi-analítica devido à sua maior precisão de medição. 
	Essa solução, composta dos sais e tomate, foi posta em aquecimento em temperaturas entre 50°C e 60° C e posteriormente foi introduzido um béquer de 250 ml com aproximadamente 30 g de tomates amassados com uso de um pistilo. Esse sistema permaneceu no aquecimento entre 10 e 15 minutos, em seguido foi usado um choque térmico com uma cuba cheia de gelo em que o béquer com tomate foi posto permanecendo por 5 minutos. Durante o banho-maria e o choque térmico, a solução foi agitada suavemente em intervalos de 5 minutos.
	Em seguida foi realizada uma filtração com pressão reduzida, com uso de um kitassato de 125 ml, suporte universal, mufa, garra, mangueiras, papel de filtro com tamanho compatível com o funil de Büchner, além de um fraco de segurança pois havia possibilidade de formação de espuma durante o processo.
	Terminada a filtração, houve uma homogeneização do conteúdo filtrado por meio de movimento circulares. O conteúdo do béquer após filtração foi divido igualmente entre três tubos de ensaio. E, depois, foram adicionados 10 ml de etanol em cada tubo de ensaio, permanecendoem repouso por aproximadamente um minuto.
	Finalmente, percebeu-se que o DNA do tomate se formou na fase alcoólica, tendo uma forma gelatinosa. O DNA foi retirado da solução com uso de pinças e posteriormente foi feita sua análise visual com síntese dos conhecimentos adquiridos sobre um dos processos para extração industrial.
DISCUSSÃO
	Podemos identificar no procedimento em questão os passos gerais dos processos usualmente empregados na extração de DNA. [7] São eles: 
maceração: quebra a parede celular e aumenta a superfície de contato, providenciando um melhor ambiente para a ação da solução de lise;
sais: agem neutralizando a carga negativa do grupo fosfato do DNA (observado na figura a seguir) e a carga positiva das proteínas inicialmente ligadas ao DNA, possibilitando a aglomeração das moléculas de DNA sem que haja repulsão entre elas. Para tal, qualquer sal pode ser utilizado. Em nosso experimento, foram usados o cloreto de sódio e o citrato de sódio;
Figura 2 Estrutura química dos componentes da molécula de DNA. [5: Retirado de http://s197.photobucket.com/user/sarajkl/media/Digitalizar0011.jpg.html.]
detergente: o detergente desconstrói as moléculas de lipídeos da membrana plasmática e da membrana nuclear;
etanol: desidrata a molécula de DNA, separando-a do meio aquoso. Além disso, dificulta a dissolução do DNA, pois possui caráter apolar. O etanol foi utilizado em baixas temperaturas para que diminuísse a solubilidade da molécula de DNA;
banho-maria: proporcionar um melhor ambiente para a ação do detergente, contribuindo com a solubilização das membranas. Provoca, ainda, a desnaturação de diversas proteínas e enzimas, dentre elas, algumas que podem degradar o DNA, como as DNAses;
choque térmico: teve o objetivo de manter ociosas as proteínas e enzimas, e também de favorecer o estado esticado do DNA, em fitas.
	Vale destacar a importância da maceração quando se trata de células vegetais uma vez que estas têm uma estrutura celular muito mais resistente devido a parede celular. 
O detergente é um dos componentes mais importantes do procedimento, uma vez que possibilitará a quebra das membranas plasmática e nucleica, formadas principalmente por lipídeos, permitindo a extração do DNA. [7] O uso de detergentes de melhor qualidade como o CTAB ou SDS, ainda que desnecessário considerando a finalidade da experiência, traria melhores resultados. [8]
Quanto aos sais, poderiam ter sido utilizados qualquer um, mas dá-se preferência aos sais cujos cátions são pertencentes à família dos metais alcalinos. No caso do NaCl, sua dissociação em íons Na+ serve para neutralizar a carga negativa do grupo fosfato do DNA enquanto o Cl- neutraliza as cargas positivas das proteínas que estavam ligadas ao DNA. Isto contribui para a aglomeração da molécula uma vez que ela não sofre repulsão de cargas opostas. [7]
Para a precipitação do DNA foi utilizado o etanol, pois apresenta baixa toxicidade, não apresentando riscos à saúde dos alunos. Porém, poderiam ter sido substituídos por substâncias como isopropanol, fenol e clorofórmio.
Um aspecto interessante é a confusão que eventualmente se faz sobre a observação do DNA. Frequentemente, em experiências de extração do material genético de células vegetais, há quem suponha estar vendo o DNA quando, na verdade, está vendo a pectina que é uma substância também gelatinosa e que se forma na fase alcoólica. O cuidado que se deve ter está justamente na posição de precipitação visto que o DNA costuma se agregar à interface entre o álcool e a fase aquosa. Já a pectina se precipita na superfície do álcool e forma bolhas de ar. [9]
CONCLUSÃO
	Neste experimento, tivemos por objetivo extrair o DNA de um tomate. Para tanto, utilizamos uma variação mais simples de um procedimento amplamente usado na extração de DNA de células vegetais. A aplicação de tal técnica em um curso introdutório de Química apresenta conceitos fundamentais cuja generalização é facilmente aplicável a outros métodos mais sofisticados.
	Se compararmos o nosso resultado com aquele obtido por modelos de extração mais sofisticados, observamos que nosso método tem um produto mais impuro e em menor quantidade, uma vez que não foram aplicados alguns cuidados necessários no que se refere à purificação do material genético extraído. Houve, por exemplo, grandes chances de perda no processo de filtração a vácuo a partir da formação de espuma. Podemos dizer, no entanto, que, considerando a simplicidade do procedimento, os resultados obtidos foram satisfatórios, permitindo a visualização a olho nu de um aglomerado de DNA. 
	Como já mencionado anteriormente, a prática deste procedimento mais simples é de extremo auxílio no aprendizado de técnicas mais avançadas. 
REFERÊNCIAS