Relatório das práticas de microbiologia uninassau

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CENTRO UNIVERSITÁRIO MAURÍCIO DE NASSAU
CURSO DE GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA QUIMICA
RELATÓRIOS DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Hélio José Da Silva
Iasmin Constantino Barbosa do Nascimento
Maria Izabel Medeiros Salvador de Alcântara
Mariana Costa Couto
Rafaela Maria Oliveira Santoro
RECIFE
2016
Hélio José Da Silva, Iasmin Constantino Barbosa do Nascimento, Maria Izabel Medeiros Salvador De Alcântara, Mariana Costa Couto, Rafaela Maria Oliveira Santoro.
RELATÓRIOS DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Relatório referente à graduação de Engenharia Química, como requisito parcial para obtenção da primeira nota da disciplina de microbiologia industrial, ministrada pela professora Maria Clara.
RECIFE
2016
VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS DE LABORATÓRIO
Introdução
As boas práticas de laboratório podem ser consideradas como um conjunto de diretrizes que promovem o trabalho e a conduta laboratoriais adequados e um dos principais propósitos é garantir que os resultados sejam uma representação válida de uma amostra. Para alcançar esse objetivo, é importante considerar todas as etapas de uma análise e adotar procedimentos adequados em cada uma delas. (HAGE, 2012).
Boas práticas de laboratório pressupõem que haja métodos bem definidos que descrevem como o trabalho de rotina em laboratório deve ser realizado, objetivo esse alcançado através de um procedimento operacional padrão (ou POP). Este procedimento trata de um conjunto especifico de instruções que descreve como uma tarefa deve ser executada. Em um ambiente de ensino um POP costuma ser o relato escrito de uma experiência a ser fornecido aos alunos por seu instrutor ou por meio de um manual de laboratório. (HAGE, 2012).
É provável que a parte mais importante das boas práticas de laboratório consista em garantir a segurança da realização das experiências. Um laboratório de análises químicas costuma ser um lugar seguro para se trabalhar pois em geral é um local onde se lida com pequenas quantidades de substancias químicas e as reações empregadas normalmente não são perigosas, entretanto mesmo em um cenário como esse é possível que acidentes ocorram. (HAGE, 2012).
Há muitas coisas que podem ser incluídas no âmbito da categoria de “segurança em laboratório” que vão desde o uso de uma área de trabalho bem projetada até a disponibilidade de equipamento de segurança e treinamento adequado do pessoal do laboratório. (HAGE, 2012).
Basicamente para um trabalho adequado em laboratório deve se ater a três detalhes: a minimização da exposição a substancias químicas, pois sempre que se estiver lidando com substancias químicas é prudente conhecer os diversos meios pelos quais essas substancias podem entrar no corpo, seja por inalação, contato com a pele, ingestão ou por injeção. A armazenagem química, o objetivo de um correto armazenamento é manter de forma estável a substancia para que não apresente risco ou ocorra qualquer interação com substancias que estejam próximas. E o descarte químico, onde vai além de apenas lidar com o excedente de produtos ou de reagentes produzidos durante um experimento, pois inclui também a gestão de substancias que atingiram o prazo de validade ou que podem ter sido modificadas em sua composição original. (HAGE, 2012).
Metodologia
Materiais 
Os materiais utilizados foram: Pera, Dessecador, Grau, Cadinho, suporte universal, Proveta, Pisseta, Funil de separação, Balão de fundo chato, Tripé, Pistilo, pipeta volumétrica, pipeta graduada, Pinça de madeira, Lâmina, Erlenmeyer, Kitassato, Lamparina, Alça de drigalski, Alça de vidro, Placa de plástico, Becker, Espátula, estante, tubo de ensaio, pipeta de Pasteur, Bureta, Vidro Relógio, Balão volumétrico, Tela de Amianto, Funil de Brucker, Pinça, Placa de Petri e Alça de Platina.
Procedimento Experimental
Sobre a bancada foram dispostos vidrarias e equipamentos, enumerados de 1 a 33 e no quadro foram colocados os nomes dos mesmos de forma a relacionar aos números inscritos na bancada dos equipamentos.
Após a identificação foi realizada a correção junto a professora assim como a descrição de cada equipamento e vidraria.
Resultados
Sobre a bancada do laboratório foram dispostos equipamentos e vidrarias numerados de 01 a 33 para ser identificados conforme a FIGURA 1 e relacionados com os nomes escritos na lousa.
FIGURA 1 – Disposição dos equipamentos e vidrarias sobre a mesa para a Identificação.
Conclusão
A constatação e confirmação das vidrarias e equipamentos foram efetuadas de forma rápida devido aos conhecimentos adquiridos em laboratórios anteriores em diferentes disciplinas ministradas à turma de engenharia química, portanto não houve dificuldade em determinar os equipamentos e nem suas utilidades em um laboratório.
Referências Bibliográficas
HAGE, DAVID.S e JAMES D. CARR. Química analítica e análise quantitativa. 1ª ed. São Paulo: Pearson Prentice Hall, 2012. p. 11,12,15, 20-21. 
JAMES M. POSTMA, JULIAN L. ROBERTS JR. e J. LELAND HOLLENBERG. Quimica no laboratório. 5ª Ed. São Paulo: Manole, 2009.
VIDRARIAS DE LABORATÓRIO. 
,Disponível em < http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/vidrarias-de-laboratorio-2/> acesso em 07 de outubro de 2016.
PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTURA E INOCULAÇÃO DE MICRORGANISMO
Introdução
O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras referências para a sua classificação. É significativo conhecer a potencialidade do crescimento de cada meio de cultura e apropriar ao perfil bacteriano almejado para cada recipiente (DUNLAP, 2010).
 Os meios de cultura podem ser preparações sólidas, líquidas ou semi-sólidas que contêm todos os nutrientes necessários para o crescimento de microrganismos, os mesmos são utilizados com a finalidade de cultivar e manter microrganismos viáveis no laboratório para o seu crescimento, sob a forma de culturas puras. Além de nutrientes é equitativamente necessário que as condições de oxigénio seja na presença ou ausência do mesmo, pH e pressão osmótica sejam adequadas ao crescimento desses microrganismos (DUNLAP, 2010).
 Os meios de cultura devem ter na sua composição, os nutrientes indispensáveis ao crescimento do organismo em questão e em concentração não inibitória do crescimento. Além disso, após a sua preparação, cada meio de cultura deve ser submetido à esterilização, por forma a eliminar qualquer organismo vivo contaminante (ENGELKIRK, 2012).
 Um meio de cultura líquido contem todos os nutrientes necessários ao crescimento do microrganismo, dissolvidos em água. Uma vez preparado, este pode ser inoculado com uma cultura pura do microrganismo que se pretende cultivar e ser colocado a incubar em condições óptimas (temperatura e arejamento) para o crescimento do microrganismo (ENGELKIRK, 2012).
 Por modo de verificar o grau de pureza do inóculo preparado, recorre-se, frequentemente, à transferência de uma amostra do inóculo para a superfície de um meio de cultura sólido com a mesma composição, contido numa placa de Petri (ENGELKIRK, 2012).
 Sólidos os meios de cultura são preparados a partir da adição, ao meio líquido correspondente, de um agente solidificante, antes da esterilização do meio. Os meios de cultura podem ainda ter um estado físico intermédio, que é obtido através da adição de uma quantidade reduzida de agente solidificante que é entre 0.3 a 0.5% de agar. A consistência menos firme destes meios permite a mobilidade de microrganismos que sejam móveis (TORTORA, 2005).
 O Agar é um meio de cultura obtido a partir de algas marinhas vermelhas e formado por uma combinação de agarose e agaropectina, usada para meios de culturas sólidas de bactérias. Tem como característica a capacidade de continuar maleável mesmo quando exposto a temperaturas altas, o que permite sua utilização dentro do escopo de investigação laboratorial (TORTORA, 2005).
 Em 1892, Raymond Sabouraud,criou o àgar de Sabouraut que tem a utilidade de favorecer o crescimento de diversos fungos leveduriformes e filamentoso que são colônias gigantes. O ótimo crescimento dos fungos se deve às altas concentrações de carboidratos. O meio não dispõe de inibidores de microflora acompanhante, mas agentes inibidores podem ser adicionados. O pH do meio, levemente ácido, inibe o desenvolvimento de algumas bactérias e de algumas espécies de fungos. Enquanto o caldo Sabouraud é um meio líquido que serve para dar o comando da esterilidade e para a realização de procedimentos baseados na utilização de membranas filtrante (TORTORA, 2005).
 Após autoclavagem, os meios sólidos vertem-se em caixas de petri de forma a cobrir uniformemente o fundo da caixa e após solidificação guardam-se por 3 noites na estufa a 37oC para testar a sua esterilidade e em seguida no frigorifico até à altura das sementeiras. Os meios sólidos podem também ser vertidos em tubos de ensaio de vidro (ENGELKIRK, 2012).
 O desenvolvimento de certos tipos de microrganismos e inibidores do crescimento de outros microrganismos é permitido pelo meio seletivo. Ele contém inibidores, normalmente antibióticos, que tornam inviável o crescimento de certos microrganismos, sem inibir o crescimento do microrganismo alvo. O Agar MacConkey inibe o crescimento de bactérias gram-positivas, selecionando assim as bactérias gram-negativas (TORTORA, 2005).
 Utilizados para diferenciar microrganismos ou grupos de microrganismos em um meio, o Meio de Cultura Diferencial, na presença de determinados produtos químicos nos meios produzirão certas alterações características ou padrões de crescimento que são utilizados para a identificação ou a diferenciação de microrganismos (ENGELKIRK, 2012). 
 Regularmente é utilizado o Agar MacConkey que diferencia vários bacilos gram-negativos isolados de amostras de fezes. As bactérias gram-negativas que são capazes de fermentar a lactose produzem colônias rosa, enquanto aquelas incapazes de fermentar a lactose produzem colônias incolores. Assim, o Agar MacConkey diferencia as bactérias gram-negativas fermentadoras das não fermentadoras da lactose (MURRAY, 2006).
 Enquanto os Meios de Enriquecimento é quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros (MURRAY, 2006).
Metodologia
Materiais e Reagentes
As vidrarias e reagentes utilizados foram: Colônia de microorganismos; Agar Nutriente; Agar Sabouraud; Autoclave; 3 Placas de Petri; 1 Caneta de retroprojetor; 2 Cotonetes; Fita de autoclave; Água estéril; Lamparina em vidro.
	Procedimento experimental
Preparação das placas de Petri
Enquanto aguardou-se a autoclavagem, na parte inferior de uma das placas foi anotado “Agar Nutriente” e no outro “Agar Sabouraud” com uma caneta retroprojetora. 
Em ambas as placas foram anotadas o nome do grupo e a data com uma caneta retroprojetora. 
 Após o meio de cultura passar pelo processo de esterilização e estar fria, a chama da lamparina foi acesa com o auxílio da professora.
 Testes
No quadrante teste 1 onde possuía Agar Nutriente: Esfregou-se um cotonete na superfície superior da boca de um voluntário e em seguida essa amostra foi depositada no quadrante por meio do cotonete.
No quadrante teste 2 onde possuía Agar Nutriente: Esfregou-se um cotonete na superfície do celular e em seguida essa amostra foi depositada no quadrante por meio do cotonete.
No quadrante teste 3 onde possuía Agar Nutriente: Esfregou-se a mão em locais contaminados e em seguida essa amostra foi depositada no quadrante por meio do dedo.
No quadrante teste 1 onde possuía Agar Sabouraud: Esfregou-se um cotonete na superfície superior da boca de um voluntário e em seguida essa amostra foi depositada no quadrante por meio do cotonete.
No quadrante teste 2 onde possuía Agar Sabouraud: Esfregou-se um cotonete na superfície do celular e em seguida essa amostra foi depositada no quadrante por meio do cotonete.
No quadrante teste 3 onde possuía Agar Sabouraud: Esfregou-se a mão em locais contaminados e em seguida essa amostra foi depositada no quadrante por meio do dedo.
As placas de Petri foram fechadas e depositadas de cabeça para baixo em uma estufa a 37ºC por 3 noites inteiras.
Após a incubação das placas na estufa foi verificado se houve ou não crescimento de microorganismos.
Resultados
 Após 3 noites de repouso do meio de cultura, foram observados em laboratório, os resultados obtidos da experiência.
 No quadrante 1, 2 e 3 que possuía Agar nutriente é um meio de cultura geralmente utilizado rotineiramente para todos os tipos de bactérias. É muito útil porque ele permanece sólido mesmo a temperaturas relativamente elevadas. Além disso, este crescimento bacteriano em Agar faz na superfície, de modo a que melhor distinguir as colónias pequenas. 
 Em caldo nutriente, as bactérias crescem no líquido, e aparece como uma substância de espessura, com as colónias dificilmente observáveis. Sendo composto geralmente por extratos de carne e levedura, o ágar nutriente é utilizado para cultivo de microrganismos pouco exigentes nutricionalmente, os principais são Escherichia coli e Streptococcus pneumoniae.
 No quadrante 1, 2 e 3 que possuía Agar Saboraud ocorreu o favorecimento do crescimento dos fungos, pois tem um pH baixo e uma alta concentração de glicose, gerando principalmente o cultivo e crescimento de espécies de Cândidas e fungos filamentosos possuindo colônias gigantes, particularmente associados a infecções superficiais.
 O Agar Saboraud (ASD), na sua composição usa-se um antibiótico para impedir o crescimento de bactérias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos. O cloranfenicol é o mais indicado, pois resiste à autoclavação. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos.
 Meios ditos seletivos para fungos patogênicos contém cicloheximida que inibe parcialmente, ou totalmente, fungos anemófilos. Estes meios são indicados para cultivo de materiais coletados de lesões com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatófitos. Mas, deve-se ressaltar que esta substância poderá inibir o isolamento de fungos oportunistas, como Aspergillus sp, além de Histoplasma capsulatum na fase leveduriforme e certas leveduras patogênicas dos gêneros Cândida e Cryptococcus. 
Leveduras do gênero Cândida são os maiores agentes de infecção e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com doenças graves. A Cândida foi notificada como 6º patógeno nosocomial e a 4ª causa mais comum de infecções de corrente sanguínea.
Conclusão
Após três noites de crescimento pudemos observar que houve a proliferação de colônias não só de bactérias, mas também de fungos. Logo, o objetivo do experimento foi atingido. As colônias de bactérias estão em um meio seletivo, pois engloba componentes que gera a inibição do crescimento de bactérias Gram positivo permitindo que as Gram negativo cresçam e, por outro lado, é um meio diferencial. Enquanto à colônia de fungos definimos que, mesmo manuseando as placas na zona de segurança, este fungo foi capaz de penetrar o meio e se reproduzir, já que não havia qualquer agente que pudesse inibir seu crescimento.
Referências Bibliográficas
DUNLAP; MADIGAN; MARTINKO. Microbiologia de Brock . 12ª Ed. Editora: Artmed. 2010
G., ENGELKIRK, Paul, DUBEN-ENGELKIRK, Janet, and BURTON, Gwendolyn R. W.Burton Microbiologia para as Ciências da Saúde, 9ª edição. Guanabara Koogan, 2012.
T., MADIGAN, Michael, MARTINKO, John M., DUNPLAP, Paul V., and CLARK, David P. Microbiologia de Brock, 12ª edição. ArtMed, 2011
MURRAY, P.R. e cols. Microbiologia Médica. 5ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2006.
TORTORA, G.R. Microbiologia. 8ª Ed.Porto Alegre: Artmed, 2005.
COLORAÇÃO DE GRAM
Introdução
As mais simples e menores das células são conhecidas como Procariotos; e consistem de diferentes famílias de microrganismos unicelulares geralmente chamados de bactérias. As células procarióticas foram as primeiras a surgir na evolução, já as células eucarióticas surgiram talvez um bilhão de anos depois dos procariotos e são muitos maiores, complexas e apresentam um leque maior de diversidade e diferenciação. Elas são os tipos de células encontradas em todos os animais multicelulares, plantas e fungos (LEHNINGER, 2002).
Há cerca de 20 famílias diferentes de procariotos, que são classificados ou nomeados de acordo com sua forma, sua capacidade para locomoção, suas características de coloração, suas preferencias nutricionais ou produtos que sintetizem. Algumas são patogênicas, mas muitas são benéficas (LEHNINGER, 2002).
A parede celular da maioria das bactérias consiste de uma estrutura em rede, mantidas por ligações covalentes, e que envolvem completamente a célula. Ela é constituída por cadeias de polissacarídeos longas e é chamada de mureína ou peptidoglicana podendo ser considerada como uma única e enorme molécula, onde possui conformidade diferente entre bactérias gram-positivas e gram-negativas (LEHNINGER, 2002).
A maioria das observações iniciais dos micro-organismos é feita por meio de preparações coradas, porém, antes que os micro-organismos possam ser corados, devem ser fixados à lâmina do microscópio. A fixação simultaneamente mata os microrganismos, os fixam na lâmina e também preserva várias partes dos micróbios em seu estado natural com apenas um mínimo de distorção (TORTORA, 2005).
Quando uma amostra precisa ser fixada, coleta-se parte do material contendo os microrganismos e espalha-os sobre a superfície da lâmina com água e põem-se para secar, pela passagem repetidamente sobre a chama de um bico de Bunsen, com o lado contendo o material para cima. A coloração é aplicada e então lavada com água e secada. Sem a fixação, a coloração poderia lavar os micróbios da lâmina (TORTORA, 2005).
Os corantes são sais compostos por um íon positivo e um íon negativo, um dos quais é colorido e conhecido como cromóforo. A cor dos assim chamados corantes básicos está no íon positivo; em corantes ácidos, está no íon negativo. As bactérias são levemente carregadas negativamente em pH 7 desse modo tem preferências por corantes básicos que incluem o cristal violeta, o azul de metileno, o verde de malaquita e a safranina (TORTORA, 2005).
	Coloração de Gram é uma técnica de coloração usada para diferenciar os microrganismos através das cores, para serem observados em microscópio óptico. A técnica recebeu este nome em homenagem ao médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram, onde o mesmo observou que as bactérias, após serem tratadas com diferentes corantes, adquiriram cores diferenciadas (LIBERTO, M.I.M., 2012). Estudos de microscopia eletrônica e análises bioquímicas permitiram concluir que a parede celular bacteriana é a estrutura responsável pelo diferente comportamento das bactérias à coloração de Gram. As que ficavam roxas foram classificadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, foram chamadas de Gram-negativas.
As bactérias Gram-Positivas apresentam uma parede espessa, homogênea, geralmente sem camadas e predominantemente constituída por peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolúvel que se forma fica retido no interior da célula pela camada de peptidoglicano, logo, estas células não são descoradas permanecendo com a coloração do corante de cor púrpura. As bactérias Gram-negativas apresentam uma parede estratificada constituída por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contém peptidoglicano e que é mais fina que a das Gram-positivas. Por causa disso o precipitado insolúvel é removido (camada de peptidoglicano é mais fina que a das Gram-positivas e a membrana externa é solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as células ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante (MADIGAN, 2010).
A técnica de Gram é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia (VERMELHO, 2006).
Metodologia
Materiais 
Os materiais utilizados foram: Reagentes de Gram: sol. cristal-violeta 2%; sol. aquosa de iodo (Lugol); mistura álcool-acetona; sol. fucsina, Lâminas de vidro; alça de platina; lamparina;  Microscópio; Óleo mineral.
Procedimento Experimental
Pegou-se o material biológico feito na aula anterior e foi coletada uma colônia com a alça de platina. 
Essa colônia é adicionada na lâmina de vidro com uma gota de água para a realização do esfregaço. 
Após a mistura da colônia com a água, a lâmina de vidro é aquecida lentamente na lamparina até secar. 
Com a fixação feita, a coloração é iniciada com a coberta do esfregaço com o violeta de cristal por um minuto, lavando com água corrente em seguida. 
Depois desse processo Cobre-se com lugol por um minuto e retira-o também com água corrente. 
Logo em seguida ocorre o processo de descorar, cobrindo com o álcool-acetona por 30 segundos e lavado na água corrente. 
E para finalizar cobre-se com fucsina por 30 segundos e lava-se na água corrente novamente deixando secar no ambiente.
Depois de ter completado a etapa de coloração, inicia-se a etapa de visualização no microscópio, onde a lâmina é posicionada e visualizada no aumento de 4x, 10x, 40x e 100x. Antes de ser colocada na lente de aumento de 100x Adiciona-se óleo mineral para evitar danos na lente.
Resultados
As figuras abaixo determinam o Procedimento de coloração:
FIGURA 2 – Etapa de diluição da colônia em água e secagem sobre a lamparina;
FIGURA 3 – Etapa de coloração com Violeta de Genciana;
FIGURA 4 – Etapa de coloração com Lugol, realizado após a lavagem do Violeta com água.
FIGURA 5 – Etapa de coloração com Fucsina, após a lavagem do Lugol.
 FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5 
Pegando como exemplo, analisamos as placas com maior número de colônia, que foi a do dedo, nas lentes de 4x, 10x, 40x e 100x, no Ágar nutriente onde encontramos cocos gram negativo (FIGURA 6, 7, 8 e 9) e no Agar Saboraud foram encontrados cocos gram positivos (FIGURA 10, 11, 12 e 13), explicando assim o fato dela ter uma infecção no sangue, onde pode ser encontrado por causa da Levedura do gênero Cândida.
 FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9 
 
FIGURA 10 FIGURA 11 FIGURA 12 FIGURA 13 
Conclusão
Ficou observado nos esfregaços que foram preparados que as bactérias do tipo gram-negativas adquiriram uma coloração rosa/ vermelha, por causa da sua composição de sua parede celular. Já as bactérias de coloração mais violeta/azul, caracterizaram as gram-positivas, cuja a característica da formação da parede celular foi decisiva para esse efeito dos corantes na colônia. Ou seja, as gram-negativas possuem mais lipídeos em sua composição, e são mais permeáveis, por ter menos peptidioglicanos. Assim, quando aplicamos o álcool, os lipídeos de sua parede celular são dissolvidos, perdendo-se a coloração violeta do cristal violeta. Aplicando-se fucsina, de cor avermelhada, a bactéria gram-negativa adquire a coloração desta substância. Já as bactérias gram-positivas, têm menos lipídeos na parede celular e possuem uma camada mais espessa de peptidioglicanos, sendo assim menos capaz de permeabilidade ao álcool. Portanto, ela permanece com a coloração fornecida pelo cristal violeta: violeta. Sendo que o lugol apenas permite a melhor visualização do cristal violeta..
Referências Bibliográficas
LIBERTO, M. I. M.; CABRAL, M. C.; LINS, U. G. C. (2006). Microbiologia. V.1. 2. ed. Rio de Janeiro: Fundação Cecierj, 2006. 
TORTORA, GerardJ., FUNKE, Berdell R. e CASE, Christine L. Roberta Marchiori Martins.Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2005. 
T., MADIGAN, Michael, MARTINKO, John M., DUNPLAP, Paul V., and CLARK, David P. Microbiologia de Brock, 12ª edição. ArtMed, 2011.
FILHO, G. N. S., Microbiologia. Manual de aulas práticas. Ed.Da UFSC, 2004
Vermelho, A. B; Pereira . A. F; Coellho R.R.R; SOUTO. Padron, T. Práticas de Microbiologia, Guanabara Koogam, 2006. 
DILUIÇÃO SERIADA E TÉCNICAS DE PLAQUEAMENTO (Pour Plate e Estriamento)
Introdução
Bactérias em pequeno número pode se perder se outras bactérias estiverem presentes em maior número, e algumas vezes, é necessário utilizar uma cultura de enriquecimento. O meio para enriquecer uma cultura geralmente é liquido e fornecem nutrientes e condições ambientais que favorecem o crescimento de um microrganismo específico e não de outros. De forma que parece ser um meio seletivo, mas elaborado para amplificar a níveis detectáveis um número muito pequeno do microrganismo de interesse (TORTORA, 2005).
São utilizados alguns métodos para a obtenção de culturas puras, e o método consiste em transferências de uma pequena quantidade de material entre frascos de mesmos meio. Após uma série de transferência a população sobrevivente consistirá em colônias da seleção das bactérias que se deseja estudar (TORTORA, 2005).
Uma colônia visível teoricamente vem de um único esporo ou célula vegetativa ou de um grupo dos mesmos microrganismos juntos em agregados ou cadeias. As colônias microbianas frequentemente têm aparência diferente, o que permite distinguir um microrganismo do outro. As bactérias devem ser separadas de maneira suficientemente ampla na placa para que as colônias possam ser separadas uma das outras (TORTORA, 2005).
Dentre os métodos de isolamento mais utilizados estão o método de Estriamento e o método Pour Plate. O método de estriamento consiste em mergulhar uma alça de inoculação estéril dentro de uma cultura mista, que contém mais de um tipo de microrganismo e é semeada em estrias na superfície de um meio nutritivo. Ao longo da estria as bactérias são depositadas quando a alça entra em contato com o meio e as últimas células depositadas na alça são afastadas o suficiente para crescer em colônias isoladas (TORTORA, 2005).
O método de esgotamento por estrias funciona bem quando o organismo a ser isolado está presente em grande número em relação a população total. Contudo, quando o micro-organismo a ser isolado está presente em um número muito pequeno, sua quantidade pode ser aumentada por enriquecimento seletivo antes do isolamento com o método de esgotamento por estrias (TORTORA, 2005).
Quanto ao método de Pour Plate, suas principais aplicações são os ensaios de contagem total de aeróbios mesófilos, contagem de clostrídios sulfito redutor, contagem de enterobactérias, contagem de enterococos e contagem de bactérias lácticas (SILVA, 1991).
A  versatilidade da técnica é decorrente do princípio envolvido na contagem, baseado na premissa de que, quando fixada em um meio de cultura sólido adequado, cada célula microbiana presente na amostra irá formar uma colônia isolada. Variando-se o tipo de meio de cultura (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio seletivo diferencial) e as condições de incubação (temperatura e atmosfera), é possível selecionar o grupo, gênero ou espécie que se deseja contar (SILVA, 1991).
Metodologia
Materiais e Reagentes
Os materiais utilizados foram: alça de platina, placa de petri, lamparina em vidro, tubo de ensaio e alça de drigalski.
	Procedimento experimental
Para a diluição seriada:
Com a alça de platina pegar uma colônia de uma placa e dissolver no meio líquido. Ao colocar a colônia no tubo de ensaio, dissolver bem até o meio ficar turvo. Este meio será distribuído em 5 tubos de ensaio da seguinte forma: no 1º tubo colocar 10 mL de água destilada misturada com uma colônia preparada na aula anterior e a partir do 2º tubo de ensaio colocar 9 mL de água destilada mais 1 mL do caldo nutritivo do tubo anterior. 
Após a diluição seriada, iniciar a técnica de plaqueamento.
Para a técnica de plaqueamento:
Método de Pour Plate: 
Separa 2 placas com meio de cultura AN;
Adicionar 0,5 mL da cultura diluída 1x (tubo 1) na placa e com a alça de drigalski espalhar o líquido homogeneizando suavemente em movimentos circulares até secar;
Fazer o mesmo procedimento com a cultura diluída no tubo 5.
Método de Estriamento:
Separar 2 placas com meio AN;
Mergulhar a alça de platina no tubo 1 e fazer o estriamento na placa 1;
O estriamento deve ser feito em zigue-zague sem encostar uma linha na outra e sempre que girar a placa flambar a alça.
Resultados
O objetivo da técnica de pour plate utilizada era para se obter a contagem bacteriana. Utiliza-se para análise de microrganismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido 	após o endurecimento da camada com ágar nutriente. 
As placas ficaram na estufa por 2 noites e ao verificar a placa de petri, observou-se que houve uma troca na tampa das placas, uma vez que, a placa de nº 1 deveria ter um número maior de colônias por estar mais concentrada (foi retirada do tubo 1), enquanto que a placa nº 5 deveria ter um quantitativo menor de colônias já que trata-se de uma solução mais diluída (foi retirada do tubo 5). Ainda assim, diante os resultados não foi possível contar o número de colônias da placa 1 (tubo 1), pois estavam acima do limite (entre 25 a 250 colônias) máximo, enquanto que a placa 5 (tubo 5) pode-se identificar uma faixa de 40 colônias e 1 (uma) colônia bem formada, sendo identificadas isoladamente conforme previsto pelo método de pour plate. 
FIGURA 14 – Técnica de Pour Plate com a placa de Petri 
nº 1 (tubo 1, menor diluição)
FIGURA 15 – Técnica de Pour Plate com a placa de Petri 
nº 5 (tubo 5, maior diluição)
A técnica de Estriamento (ou esgotamento de alça) é utilizada para obtenção de crescimento bacteriano de forma isolada, visando diminuir a população microbiana e promovendo seu isolamento em um meio puro.
O meio de cultura utilizado foi o mesmo que o de pour plate, diferenciando-se pelo forma como foi separada na placa de petri (em forma de zig-zag) com a alça de platina. Após a retirada da placa da incubadora, percebeu-se que não houve produção de colônias por estriamento nos locais onde foram espalhadas as culturas isoladas através do meio líquido (tanto do tubo 1, quanto do tubo 5). Talvez pela falta de experiência em realizar este procedimento o grupo pode ter “matado” as bactérias ao flambar a alça de platina, espalhando-a ainda quente na placa de petri, fazendo com que o procedimento não tenha sido efetuado de forma correta, ou ainda, que o meio extraído não tenha incidência de microrganismos. Mesmo diante o resultado obtido, identificou-se colônias isoladas nas pontas dos estiramentos, mostrando que algumas colônias conseguiram se desenvolver.
FIGURA 16 – Técnica de Estriamento com a placa de Petri 
nas placas 1 (a esquerda) e 5 a direita.
Conclusão
Diante os resultados obtidos, verificou-se que devido a falta de experiência do grupo em preparar amostras para identificação dos métodos de identificação de bactérias e colônias específicas, os resultados foram pouco satisfatórios. Para o método de pour plate foi visualizada a diferença quantitativa de colônias adquiridas de acordo com o grau de diluição do meio utilizado; quanto ao método de estiramento, não se sabe ao certo se o resultado foi devido à incorreta forma de utilização da placa ou se não havia microrganismos nas colônias extraídas.
Referências Bibliográficas
SEELEY, H.W. JR., VANDEMARK, P.J., LEE, J.J. (1991). Microbes in action. Ed. W.H.Freeman & Company, New York, 1991, chapter 8 & 9.
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