Variabilidade Genética em Bactérias

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Noções de genética bacteriana II 
Fernanda Abreu 
Variabilidade Genética em bactérias 
• Sobrevivência de uma espécie está relacionada a 
transferência de material genético aos descendentes; 
 
• No entanto, variações genéticas podem ocorrer e são 
responsáveis pela evolução; 
 
• Geração de diversidade e aparecimento de novas 
características fenotípicas. 
 
• Vantagem seletiva diante das modificações do 
ambiente 
 
Fluxo da informação genética 
Pergunta feita na aula 
Pergunta feita na aula 
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Variabilidade Genética em bactérias 
• Em bactérias a variação genética é decorrente 
de: 
– Mutações; 
 
– Transferência de DNA entre bactérias 
• recombinação 
Mutações 
• Definição: mudanças na sequência nucleotídica de uma 
molécula de DNA (cromossômico ou extracromossômico); 
 
• Resultante de uma substituição, deleção ou inserção de 
nucleotídeo(s); 
 
• Gerando forma variante do gene. 
 
• Como pode ocorrer? 
– Duplicação do DNA 
– Danos químicos 
– Elementos de transposição 
Espontâneos x Induzidas 
• Espontâneas: ocorrem naturalmente, geralmente em 
função de erros cometidos pelas DNA-polimerases. Não há 
ação de agente externo. São raras. 
– Outra possibilidades: danos químicos podem ocorrer 
naturalmente. 
Ex.: Desaminação da citosina, levando o aparecimento de 
uracil 
 
 Vai parear com adenina 
Espontâneos x Induzidas 
• Espontâneas: 
– Outra possibilidades: danos químicos podem ocorrer 
naturalmente. 
Ex.: Desaminação da adenina em hipoxantina  2 pontes de 
H com citosina 
 Desaminação da guanina em xantina  2 pontes de H 
com citosina 
 
Espontâneos x Induzidas 
• Ex.: Hidroxilamina: introduz –OH no grupo amina da citosina 
 pareamento com adenina 
Espontâneos x Induzidas 
• Mutações induzidas: ocorrem devido a ação 
de um agente externo (agente físico ou 
químico – agentes mutagênicos). 
Principais tipos de mutação 
1. Substituição de bases; 
– Mutação silenciosa 
– Mutação da sentido alterado conservativa 
– Mutação de sentido alterado não conservativa 
– Mutação sem sentido 
 
2. Mutações que alteram a sequencia de leitura 
das bases (frameshifts) 
– Inserção de nucleotídeos 
– Deleção de nucleotídeos 
Mutação – Substituição de bases 
• Também chamada de mutação de ponto ou pontual; 
 
• Classes das substituição: 
– Transições (mais comuns) 
 
• purina por purina (A G ou GA) 
 
• pirimidina por pirimidina (CT ou TC) 
 
– Transversões 
 
• purina  pirimidina 
Mutação – Substituição de bases 
• Tipos de mutações pontuais 
 
1. Silenciosa: altera códon, mas continua 
codificando mesmo aa. Sem alteração no 
polipeptídeo. Sem alteração fenotípica. 
 
2. S. alterado conservativa: altera códon, 
codificando aa com propriedades semelhantes. 
 
3. S. alterado não conservativa: altera códon, 
codificando aa com propriedades diferentes. 
 Setina  Treonina ---- Neutro Hidrofóbico 
 Resultado no polipeptídeo: atividade parcial ou 
inativa ou função alterada. 
 
Mutação – Substituição de bases 
• Tipos de mutações 
pontuais 
 
 
4. Sem sentido: 
• Criação de códon de terminação; 
• Parada prematura da cadeia 
polipeptídica 
• Resultado: peptídeo truncado; 
• Maior parte dos casos: perda de 
função. 
Mutação - Frameshifts 
1. Inserção de nucleotídeos 
- Forma de leitura dos códons é alterada a partir do ponto em que 
ocorreu a inserção 
- Efeito irá depender do ponto de onde ocorreu a inserção 
- Quanto mais próxima ao extremo 5’ do gene mais deletério é o efeito. 
Mutação - Frameshifts 
2. Deleção de nucleotídeos 
- Forma de leitura dos códons é alterada a partir do ponto em que 
ocorreu a deleção 
- Efeito irá depender do ponto de onde ocorreu a deleção 
- Quanto mais próxima ao extremo 5’ do gene mais deletério é o efeito. 
Elementos de transposição 
• Definição: segmentos de DNA que podem 
transpor de uma posição para outra dentro da 
mesma molécula de DNA ou para outra. 
-DNA que doa: replicon doador 
 
- DNA que recebe: replicon receptor 
 
-Replicon: qualquer molécula capaz de 
duplicação 
 
-Local de inserção: sítio-alvo 
 
-Recombinação independente de 
homologia 
Elementos de transposição 
• Tamanho e organização funcional variados 
• Características comuns: 
– DNA dupla fita; 
 
– Encontrados em Gram-positivas, Gram-negativas e arquéas; 
 
– Não são encontrados de forma livre e autônoma no citoplasma; 
 
– Sempre associados ao DNA cromossômico, plasmídeos ou DNA 
de fagos 
 
– Geralmente possuem terminais com repetições invertidas (sítios 
essenciais para o processo de transposição). 
 
Elementos de transposição 
• Participação de proteínas codificadas pelo próprio elemento  
transposases; 
• Endonucleases que se ligam às repetições invertidas nas extremidades e 
causam sua transposição por mecanismos específicos de recombinação. 
• Endonucleases: clivam ligações fosfodiéster não terminais; 
• Geralmente ocorre duplicação do sítio-alvo; 
• Sítio-alvo demonstra pouca especificidade; 
• Assim, a maioria do elementos de transposição apresenta transposição 
múltipla randômica. 
 
Classes do elementos de tranposição 
1. Sequencias de Inserção ou elementos IS: 
– Designados pela letra IS, acompanhada de um número em itálico; 
– Podem ser encontrados no cromossomo, plasmídeos ou integrado ao 
DNA de fagos; 
– Tamanho pequeno (>2kb); 
– Possuem apenas genes relacionados a transposição. 
Classes do elementos de tranposição 
2. Transpósons: 
– Designados pela letra Tn, acompanhada de um número em itálico; 
 
– Frequentemente em plasmídeos, mas também em integrado ao 
cromossomo e DNA de fagos; 
 
– Tamanho maior que 2kb 
 
Classes do elementos de tranposição 
2. Transpósons: 
 
– Podem ser classificados em: 
• Transposóns Complexos: repetições invertidas na extremidade; 
1 ou + genes envolvidos na transposição; 1 ou + genes 
codificando características fenotípicas adicionais. 
• Transpósons Compostos: elementos IS idênticos ou quase 
idênticos em suas extremidades, na mesma orientação ou 
orientação invertida; IS flanqueiam região central contendo 
marcadore genéticos. 
Mecanismos de Transposição 
• Tipos de mecanismos: 
1. Transposição Conservativa: elemento 
de transposição deixa o replicon 
doador e se insere no receptor. 
Geralmente replicon doador é 
reparado  circularização. 
 
2. Transposição Duplicativa: 
transposição de uma cópia do 
elemento de transposição. Ambos os 
replicons carrearão o elemento de 
transposição. 
Elementos de tranposição – Agentes mutagênicos 
• Como elementos de transposição podem 
causar mutações? 
– Transposição para sequencias de DNA 
codificadoras de genes; 
– Transposição para sequencias reguladoras, 
necessária para expressão dos genes. 
Elementos de tranposição – Agentes mutagênicos 
• Como elementos de transposição podem 
causar mutações? 
– Presença de inúmeras cópias pode causar: 
• deleção de regiões por recombinação homóloga 
• inversão de regiões por recombinação homóloga 
• fusão de moléculas diferentes de DNA 
Consequência desse eventos depende dos genes envolvidos 
Formação do cointegrado 
Variação genética em procariotos 
• Transferência de DNA entre procariotos 
 
1. Transformação 
2. Conjugação 
3. Transdução 
Transformação 
Griffith (1928) 
28 
Transformação 
• Definição: Mecanismo de transferência de genes 
através do qual um segmento de DNA livre no meio, 
oriundo da célula doadora geralmente morta e lisada, 
implanta-se na célula receptora. 
• Inserção do DNA exógeno no material genéticoda 
célula: Ocorre recombinação dependente de 
homologia  Sistema Rec bacteriano 
Doadora 
Receptora 
DNA livre 
Transformação 
Etapas da Transformação 
• Célula precisa estar no estado competente para receber DNA exógeno; 
– Estado transitório, de curta duração, geralmente do meio para o final 
da fase logarítmica de crescimento. 
• Diferença entre Gram + e Gram - 
Etapas Básicas 
Competência: Mudanças nas proteínas de 
superfície: ligação e captura do DNA 
Etapas da Transformação 
• Adsorção: ligação do DNA a superfície da célula 
– inespecífica em algumas bactérias 
– Específica em outras (necessidade de sequencia específica para que 
DNA exógeno se ligue a proteína de ligação na superfície da célula) 
• Penetração do DNA exógeno: conversão do DNA transformante em forma 
resistente a DNAases durante o processo de remoção do meio externo. 
– Apenas uma fita é internalizada, geralmente a partir do extremo 3’. 
– Associação a proteínas básicas denominadas ptn de eclipse 
receptora nuclease 
transporte eclipse 
Gram negativa: 
 
Poro na M.E. 
Etapas da Transformação 
• Substituição de um segmento de DNA na 
receptora pelo processo de recombinação por 
homologia 
A célula que sofre 
transformação é chamada de 
transformante. 
 
 
Gene a inativo: transformado 
gene A ativo. 
Transformação 
• Ocorrência: 
– Quase sempre entre bactérias da mesma espécie ou espécies 
relacionadas; 
– Recombinação dependente de homologia 
 
• Diferença entre a transformação na natureza e in vitro 
(transformação de células com plasmídeos): 
– Independente da espécie; 
– Métodos artificiais de transformação: 
• Eletroporação 
• Via protoplastos: DNA adicionado a protoplastos em meio 
hipertônico; 
• Via esferoplasto: arqueas desprovidas de parede. EDTA ou 
endopeptidases 
• Via choque térmico 
• Biobalística: bombardeamento de células com partículas contendo 
DNA 
 
 
Conjugação 
• Definição: processo altamente específico através do qual DNA é 
transferido de uma célula doadora para uma célula receptora por um 
complexo multiproteico denominado aparato de conjugação. 
MM = meio mínimo  contem apenas glicose como fonte de C 
-Presença de DNAase não 
impedia o aparecimento de 
prototróficos 
 
Necessidade de contato 
Conjugação 
• Experimentos posteriores mostraram a necessidade de plasmídeos 
conjugativos nas células doadoras (plasmídeos F). 
 
• Plasmídeos conjugativos possuem genes codificadores de estruturas ou 
moléculas na superfície da célula doadora envolvidas no contato celular; 
 
• Ocorre em Gram-positivas e Gram-negativas; 
– Gram -: plasmídeos conjugativos promovem conjugação em meio líquido e 
sólido 
– Gram +: dois tipos de plasmídeos conjugativos 
• Meio líquido: alta frequência 
• Meio sólido baixa frequência 
 
• Diferença na forma de contato entre as células 
Etapas da Conjugação 
• O processo pode ser divido do didaticamente 
em duas etapas: 
– Estabelecimento de contato entre células 
– Transferência do DNA 
Etapas da Conjugação 
• Bactérias Gram-negativas 
 
– Célula doadora apresenta pilus sexual 
(estrutura filamentosa formada pela 
ptn pilina  cilindro oco); 
 
– Pilus é necessária para 
reconhecimento da célula receptora e 
formação de pares durante a 
conjugação. 
 
– Geralmente ocorre retração do pilus e 
conversão do contato pilus/parede em 
contato parede/parede. 
 
– LPS parece ser receptor do pilus e 
Omp A parece desempenhar papel na 
estabilização dos pares. 
Etapas da Conjugação 
• Bactérias Gram-positivas 
– Mecanismo para conjugação em 
meio sólido não foi elucidado; 
 
– Mecanismo para conjugação em 
meio líquido: 
• Plasmídeos que respondem a 
ferormônios sexuais liberados no 
meio pelas células receptoras; 
 
• Ferormônios sexuais podem ser de 
vários tipos e codificados pelo 
cromossomo da receptora; 
 
• Ferormônio se liga a receptor 
específico na superfície da doadora, 
codificado pelo plasmídeo; 
 
• Produção de substância de agregação 
pela doadora, que auxiliam o 
estabelecimento do contato celular. 
Etapas da conjugação 
• Transferência do DNA 
– Transferência inicia-se com a 
clivagem da ligação fosfodiéster em 
uma das fitas no sítio nic da região 
oriT pela endonuclease chamada 
relaxase. 
 
– Relaxase permanece ligada a 
extremidade 5’P no ponto de 
contato celular; 
 
– Ocorre transferência de uma das 
fitas iniciando pelo terminal 5’ 
ligado a relaxase; 
 
– A duplicação das fitas é promovida 
pelas enzimas codificadas pelo 
cromossomo da célula. 
 
Conjugação 
• Pode ocorrer transferência de DNA cromossômico 
por conjugação; 
 
• Plasmídeo conjugativo deve estar integrado ao 
cromossomo; 
 
• Estirpes bacterianas que possuem plasmídeo 
conjugativo integrado ao cromossomo são 
denominadas Hfr (alta frequencia de recombinação). 
Conjugação de plasmídeos não 
conjugativos 
• Plasmídeos não-conjugativos são pequenos e não codificam aparato 
conjugativo; 
 
• Podem ser classificados como: 
– Plasmídeos não-conjugativos mobilizáveis: 
• Possuem oriT e genes que codificam relaxase; 
• Não possuem genes que codificam estruturas de contato celular. 
 
Não conjugativo 
Conjugação de plasmídeos não 
conjugativos 
• Podem ser classificados como: 
– Plasmídeos não-conjugativos não-mobilizáveis: 
• Não possui oriT, nem genes que codifiquem relaxase e 
aparato de conjugação. 
Transdução 
• Definição: mecanismo de transferência de 
genes entre bactérias mediado por 
bacteriófago. 
Lederberg & Zinder 
Bacteriófagos temperados poderiam 
promover a transferência de genes 
entre bactérias, pois nãocausam 
extensa degradação do cromossomo da 
célula infectada. 
Célula de Escherichia coli 
Bacteriófago 
Cromossomo de E. coli 
Forma circular do cromossomo do fago 
Ciclo lítico Ciclo lisogênico 
Recombinação 
sítio-específica 
Profago 
Replicação 
Montagem 
Lise 
Duplicação do 
cromossomo e do 
profago nas 
células filhas. 
in
d
u
çã
o
 
Transdução 
• Transdução generalizada 
– Todos os genes bacterianos têm chances iguais de 
serem empacotados nos novos vírus; 
– Fago possui apenas DNA da célula hospedeira. 
 
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Transdução 
• Transdução especializada 
– O empacotamento ocorre de forma específica, sendo necessária a 
presença de determinadas sequencias para empacotamento. 
– Fago empacota DNA bacteriano com o viral; 
– Apenas genes bacterianos vizinhos ao ponto de inserção do genoma 
viral são empacotados nos novos vírus. 
 
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Célula 
 transduzida 
Recombinação 
homóloga 
Prática 
Prática 9 
• Leitura do antibiograma 
 
– Observação do halo de inibição 
– Halo de inibição é medido em milímetros com 
auxílio de régua; 
– Medida é comparada com tabela-padrão de 
interpretação que considera: 
• Espécie/grupo de bactéria 
• Agente anti-microbiano 
• Concentração 
 
Prática 9 
Prática 9 
• Leitura de antibiograma 
– Colônia que aparecem no halo de inibição: 
• Mutantes resistentes; 
• Contaminação; 
• Coloração de Gram poderia tirar a dúvida 
 
– Halos geminados: efeito sinérgico de dois 
antibióticos