Relatório de Farmacognosia II - PRONTO

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Universidade Federal de São João Del Rei - CCO
Curso de Farmácia
Disciplina de Farmacognosia II
Doseamento de fenólicos totais com reagente Folin-Ciocalteu
Alunos: 
Aline Magalhães Gonçalves
Bianca Augusta Pereira de Paula
Camila Tavares de Sousa
Flávia Caroline Silva Domingos
Gabrielle Kéfrem Alves Gomes
Juliana Alves dos Santos Silva
Letícia Vieira
Matheus Reis Martins
Sara Batista do Nascimento
Thaís Lorenna Souza Sales
Professor: Joaquim Maurício Duarte Almeida
Divinópolis/2013
Introdução
Os compostos fenólicos são metabólitos secundários, sintetizados pelas plantas durante o desenvolvimento normal e em resposta a condições de stress, tais como infecção, ferimentos, radiação UV, entre outros. Fenólicos incluem fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados do ácido benzóico e cinâmico), cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos hidrolisáveis ​​e condensados​​, lignanas e ligninas. Em plantas, compostos fenólicos podem atuar como atraentes para os polinizadores, participantes na pigmentação vegetal, antioxidantes e agentes de proteção contra os raios ultravioleta, entre outros6. 
A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos é realizada por meio de uma variedade de técnicas, todavia, a mais utilizada é com o reagente de Folin-Ciocalteu. O reagente consiste de mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico7. Os fenóis totais em extratos de plantas reagem com o reagente redox específico, reagente de Folin-Ciocalteu, para formar um complexo azul, que pode ser quantificado por espectrofotometria no visível. A reação geralmente fornece dados precisos e específicos para vários grupos de compostos fenólicos, porque muitos compostos mudam de cor de modo diferente devido a diferenças na massa de unidade, e da cinética de reação1. 
O objetivo do presente estudo foi dosar os compostos fenólicos totais do fitoterápico Novarrutina e das drogas vegetais Crataegus e Espinheira Santa, através do reagente de Folin-ciocalteu e de técnicas espectrofotométricas. O padrão utilizado para fazer a curva de calibração foi a Rutina 0,1mg/mL.
Materiais e métodos
Materiais:
16 tubos de ensaio
1 suporte
Pipetas
Ponteiras
Pêra
Béqueres
Espectrofotômetro
Cubetas
Agitador de tubos
Na2CO3
H2O
EtOH
Folin
Novarrutina
Crataegus
Espinheira Santa
Métodos:
Para o preparo da curva de calibração, adicionou-se as seguintes quantidades de reagentes em cada tubo, com auxílio de pipetas e ponteiras, ambos os processos em triplicata:
Tabela 1: Curva de calibração (equivalentes em rutina). Solução padrão 0,1mg/mL
	TUBO
	µg
	µL
	EtOH (µL)
	H2O (µL)
	Folin (µL)
	Na2CO3(µL)
	Branco
	0
	0
	250
	2000
	250
	250
	1
	2,5
	25
	225
	2000
	250
	250
	2
	5,0
	50
	200
	2000
	250
	250
	3
	10,0
	100
	150
	2000
	250
	250
	4
	20,0
	200
	50
	2000
	250
	250
	5
	25,0
	250
	0
	2000
	250
	250
Em seguida, as soluções foram homogeneizadas no agitador de tubos e esperou-se 30 minutos para reagir.
Após isso, as amostras foram levadas para o espectrofotômetro para fosse feita a leitura de absorbância das mesmas no comprimento de onda de 750nm, tendo seus valores mostrados nos resultados. Com os valores em mãos, foi possível calcular a curva de calibração.
Em seguida, foram feitas as leituras de absorbância das tinturas, como demonstrada na tabela dos resultados.
Cálculos e resultados
Tabela 2: Absorbância de diferentes concentrações de rutina
	Rutina (µg)
	ABS 1º tubo
	ABS 2º tubo
	ABS 3º tubo
	Média
	2,50
	0,042
	0,048
	0,045
	0,045
	5,00
	0,101
	0,128
	0,123
	0,117
	10,00
	0,236
	0,121
	0,028
	0,128
	20,00
	0,205
	0,219
	0,234
	0,219
	25,00
	0,300
	0,273
	0,327
	0,300
Para construção da curva de calibração foi necessário calcular a média das absorbâncias obtidas. 
Curva de Calibração
Tabela 3: Absorbância de diferentes amostras em diferentes concentrações.
	Amostra
	Absorbância 10%
	Absorbância 2%
	Novarrutina
	1,860
	1,818
	0,661
	0,686
	Crataegus
	1,600
	1,746
	0,925
	0,916
	Espinheira Santa
	1,927
	1,665
	0,529
	0,568
Para encontrar a concentração de fenólicos totais em cada uma das amostras calculou-se a média das absorbâncias e substituiu-se o valor na equação da reta encontrada na curva de calibração.
Equação da Reta: , ou seja, 
Novarrutina
- Média de ABS 10% = (1,860 + 1,818)/ 2 = 1,839 
1,839 = 0,01[Amostra] + 0,037
0,01[Amostra] = 1,802
[Amostra] = 180,2 µg
Concentração de fenólicos totais na Novarrutina 10%: 180,2 µg
- Média de ABS 2% = (0,661+ 0,686)/2 = 0,6735 
0,6735 = 0,01[Amostra] + 0,037
0,01[Amostra] = 0,6365
[Amostra] = 63,65 µg
Concentração de fenólicos totais na Novarrutina 2%: 63,65 µg
Crataegus
- Média de ABS 10% = (1,600 + 1,746)/2 = 1.673
1,673 = 0,01[Amostra] + 0,037
0,01[Amostra] = 1,636
[Amostra] = 163,6 µg
Concentração de fenólicos totais no Crataegus 10%: 163,6 µg
- Média de ABS 2% = (0,925 + 0,916)/2 = 0,9205 
0,9205 = 0,01[Amostra] + 0,037
0,01[Amostra] = 0,8835
[Amostra] = 88,35 µg
Concentração de fenólicos totais no Crataegus 2%: 88,35 µg
Espinheira Santa
- Média de ABS 10% = (1,927 + 1,665)/2 = 1.796 
1,796 = 0,01[Amostra] + 0,037
0,01[Amostra] = 1,759
[Amostra] = 175,9 µg
Concentração de fenólicos totais na Espinheira santa 10%: 175,9 µg
 - Médias de ABS 2% = (0,529 + 0,568)/2 = 0,5485
0,5485 = 0,01[Amostra] + 0,037
0,01[Amostra] = 0,5115
[Amostra] = 51,15 µg
 Concentração de fenólicos totais na Espinheira santa 2%: 51,15 µg
Discussão
Segundo HAIDA et al. (2005), o conteúdo de polifenóis pode variar conforme diversos fatores tais como: região geográfica de plantio, variação à exposição solar, método de cultivo e fertilização aplicados, cultivar analisados, espécies analisadas, dentre outros. Por esse motivo talvez não haja um valor teórico específico para se comparar os resultados encontrados.
A monografia apresentada na Farmacopéia Brasileira para a Espinheira Santa (Maytenus ilicifolia) estabelece que suas folhas devem apresentar, no mínimo, 2% de taninos totais, avaliados com base na metodologia empregando-se a caseína. Essa monografia traz ainda uma série de informações confusas, como, determinando que “os taninos totais são constituídos de, no mínimo, 5% de fração tanante e, no mínimo, 4% de fração não tanante”. Esses valores não coincidem com outras referências, pois geralmente a fração tanante corresponde aos próprios taninos, os quais, junto com a fração não tanante compõem os chamados fenóis totais. Fica extremamente difícil então, comparar os dados obtidos na prática com qualquer outro dado encontrado em literatura.
Algumas avaliações comerciais, realizada por OLIVEIRA (2004), mostram valores obtidos de teores médios de 6%, claramente acima dos 2% citados na farmacopeia.
Semelhante ao que ocorre com a Espinheira Santa, a monografia apresentada na Farmacopéia Brasileira para o Crataegus (Crataegus spp.) estabelece que esta deva conter no mínimo 1,5% de flavonoides totais expressos como hiperosídeo (C21H20O12;464,4), em relação à droga seca. Temos, dessa forma, outro dado insuficiente para comparação com os resultados obtidos na prática. Além disso, há uma escassez muito grande de estudos sobre o doseamento de fenólicos totais nessa planta.
No caso da novarrutina, que é um medicamento fitoterápico à base de Castanha da Índia (Aesculus hippocastanum L.), tem como marcador químico, segundo sua bula, o composto escina. A monografia desta planta presente na Farmacopéia Brasileira traz que a droga vegetal é constituída de sementes maduras e dessecadas, contendo, no mínimo, 3,0% de glicosídeos triterpênicos, calculados como escina anidra. Como pode ser observado, mais uma vez não é possível uma comparação com os dados obtidos na prática.
Referências Bibliográficas:
BLAINSKI, A.; LOPES, G. C; MELLO, J. C. P; Application and Analysis of the Folin Ciocalteu Method for the Determination of the Total PhenolicContent from Limonium Brasiliense L. Molecules, v. 18, p. 6852-6865, 2013.
BRASIL. Farmacopéia Brasileira. 5ª ed. Brasília: Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2010. 546 p.
Bula do Medicamento Novarrutina®. Disponível em:
<http://www.medicinanet.com.br/bula/3790/novarrutina.htm> 
Acesso em 22/08/2013
GAMES, R. A. T. Contribuição ao controle de qualidade da Espinheira Santa (Maytenus ilicifolia Mart. Ex Reiss - Celastraceae.). 2010. 128 f. Tese (Mestrado em Farmácia)- Universidade Bandeirante Brasil, São Paulo. 2005.
HAIDA, K. S., et al. Atividade antioxidante e compostos fenólicos de Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium. Revista Saúde e Pesquisa., v. 5, n. 2, p. 360-368, 2012.
NACZK, M.; SHAHIDI, F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of Chromatography A. v 1054, p 95–111, Outubro 2004.
SOUSA, C. M. M. ET AL; Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Quim. Nova, Vol. 30, No. 2, 351-355, 2007.