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Noções de genética bacteriana I e II Eliana Barreto Bergter Farmácia- Microbiologia Geral- 2º semestre de 2016 Mecanismos que contribuem para a evolução do genoma bacteriano 1. Deleções no DNA, rearranjos e mutações de ponto. Rearranjos e deleções Rearranjos e deleções Deleções 2. Aquisição de DNA por transferência horizontal de gens através dos processos de transformação, conjugação ou transdução. Mecanismos que contribuem para a evolução do genoma bacteriano Transformação , transdução e conjugação WT WT WT Mutante Mutação Mutações Espontaneamente - Ocorrem na ausência de agentes mutagênicos através de erros ocasionais que ocorrem na replicação do DNA. Induzidas - Causadas por agentes mutagênicos que podem ser de natureza química ou física. Como as mutações podem ocorrer? Tipos de mutações Mutações de ponto – É o tipo mais comum de mutação, onde um único par de bases é substituído por outro. Mutações no código de leitura (“frame shift mutations”) - Um ou mais pares de bases são inseridos ou deletados do DNA, resultando em uma mudança na leitura dos codons. Exemplos de mutação de ponto Normal: antes da mutação Substituição de base Mutações de ponto Normal: antes da mutação Inserção Deleção Mutações no código de leitura do DNA ( “frame shift mutations”) • Mutação no código de leitura (“Frameshift mutation”): adição ou deleção de uma ou mais bases • Resulta na leitura errada dos codons. • Quase sempre resulta em proteínas inativas. Molécula normal DNA Mutação Como podemos identificar mutantes em uma população bacteriana? Seleção positiva – as células mutantes crescem ou apresentam fenótipos diferentes. Ex: mutantes resistentes a penicilina podem ser identificados pela capacidade de crescer em meio contendo o antibiótico. As células selvagens ( “wild type”) não crescem. Seleção negativa – as células mutantes não crescem. Ex: mutantes deficientes na biosíntese de histidina, não crescem na ausência deste aminoácido no meio de crescimento. As células selvagens ( “wild type”) crescem. Seleção natural de bactérias resistentes a antibióticos Detecção de mutantes usando meio enriquecido com antibióticos. Seleção positiva Bactérias sensíveis e resistentes na população Bactérias sensíveis começam a morrer Bactérias resistentes sobrevivem Como os mutantes podem ser detectados? - Mutantes nutricionais ou auxotróficos- pela técnica de “replica plate” Exemplo de seleção negativa Meio completo (+ fator de crescimento) Meio mínimo ( - fator de crescimento) mutantes mutantes Seleção de mutantes nutricionais ou auxotróficos Frequência das mutações A taxa de mutação espontânea em uma população de E.coli é de 1 em 109 células. Os agentes mutagênicos aumentam a taxa de mutação 10-1000 vezes. As mutações podem ser induzidas por agentes químicos ou físicos 1. Agentes químicos -Análogos de base -Ácido nitroso -Agentes alquilantes -Agentes intercalantes 2. Agentes físicos -Radiação UV -Radiações ionizantes substitui substitui Agentes mutagênicos químicos: análogos de bases Pareamento normal : A- 5BU Pareamento errado : G- 5BU Análogo de base: 5 bromo uracil Tratamento com 5- bromouracil Após várias replicações AT→ GC ou GC-AT Perda de um grupamento amino e pareamento com outra base Agente mutagênico químico: ácido nitroso Agente mutagênico químico: ácido nitroso Agente mutagênico químico: Ácido nitroso desaminação de bases Guanina → xantina com citosina- Continua GC Citosina → uracil com adenina – CG muda para AT Adenina → hipoxantina com citosina – AT muda para GC Agentes mutagênicos: Agentes alquilantes Se inserem nas bases adjacentes do DNA , distorcendo a estrutura tridimensional da hélice , causando inserção ou deleção de um nucleotídio durante a replicação do DNA. Agentes mutagênicos químicos: agentes intercalantes Agentes mutagênicos químicos: agentes intercalantes Brometo de etidium Agente mutagênico físico: Radiações ultra-violeta (UV) Formação de dímeros de timina Radiação UV : formação de dímeros de timina e mecanismo de reparo do DNA Reparo do DNA Dimeros de timina Agentes mutagênicos físicos: radiações ionizantes No espectro eletromagnético, a energia aumenta com o decréscimo do comprimento de onda O que pode causar? Degradação do DNA Peroxidação de lipídios Teste de Ames para substâncias carcinogênicas Em que se baseia? -Utilização de mutantes de Salmonella que requerem histidina para o seu crescimento ( bloqueio na via de síntese deste aminoácido). -A substância teste causa uma mutação reversa ( “back mutation”) nos mutantes permitindo o seu crescimento na ausência de histidina. Aproximadamente 90% das substâncias identificadas como mutagênicas pelo teste de Ames tem sido confirmadas como carcinogênicas em animais. Teste de Ames - Mutante auxotrófico - Mutação reversa Substância química causa mutação reversa 2. Aquisição de novas informações por transferência horizontal de gens através dos processos de transformação, conjugação ou transdução. Mecanismos que contribuem para a evolução do genoma bacteriano Transformação , transdução e conjugação Fluxo da informação genética Transferência de DNA em bactérias Transformação Transdução Conjugação Processos de transferência de DNA em bactérias Conjugação bacteriana : plasmídio é transferido sozinho ou integrado ao cromossoma da bactéria Demonstração da transformação bacteriana “in vivo” Transformação de Streptococcus pneumoniae avirulento (cepa R) em virulento (cepa L) - Experiência de Griffith Demonstração da transformação bacteriana “in vitro” DNA é o fator transformante Avery, MacLeod and McCarty 1944 Isolamento do “princípio transformante” Meio seletivo para detectar recombinantes genéticos Transformação bacteriana Transdução bacteriana Transdução bacteriana Conjugação bacteriana →Célula doadora Célula receptora← Como ocorre? - Transferência do DNA através do contato entre as duas células bacterianas ( formação de um par conjugante). - Transferência do plasmídio ou do cromosoma bacteriano. Conjugação bacteriana Participação de dois tipos de células: 1. Célula doadora- contém o plasmídio F ( fertilidade) e é denominada F+. 2. Célula receptora- não contém o plasmídio F e é denominada F-. 3. O DNA é transferido da F+ para a F- Esquema da conjugação bacteriana Quando o fator F se integra no cromosoma de uma célula F+, temos a alta frequência de recombinação. Conjugação bacteriana – HFr x F- Esquema da conjugação em Gram negativas Vermelho et al., 2008 Cromossoma Plasmídio conjugativo Ácido lipoteicoico Substâncias de agregação Receptor para feromônio Esquema da conjugação em Gram positivas Vermelho et al., 2008 A conjugação bacteriana requer contato célula-célula Experimento realizado por Davis ( 1950) Plasmidios e suas diferentes funções A transferência de plasmídios contendo gens de resistência (plasmídio R) ocorre por conjugação, transformação e transdução Resistência aos antibióticos mediada por plasmídios Comparação entre transformação, conjugação e transdução Característica Transformação Conjugação Transdução Método de transferência do DNA Livre,através da parede e membrana Através do plasmídio e por contato célula- célula Através de um bacteriófagoQuantidade de DNA transferida Poucos gens Variável Poucos gens Transferência do cromossoma inteiro Não As vezes Não Participação de virus Não Não Sim Necessidade de fragmento de DNA extracelular Sim Não Não Plasmídios e a tecnologia do DNA recombinante Obtenção de uma bactéria recombinante Cromosoma bacteriano Plasmídio Célula contendo gen de interesse DNA recombinante Bactéria recombinante bactéria Inserção em plantas: gen para resistência a praga Inserção em bactérias: gen para limpeza resíduos tóxicos Gen de interesse Bactéria recombinante Crescimento da bactéria e síntese da proteína de interesse Utilização de bactéria recombinante Biotecnologia: produção de insulina
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