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Estudo dirigido – Processos biológicos Ácidos Nucleicos – DNA E RNA O que são? São macromoléculas formadas a partir de sequências de nucleotídeos, que são responsáveis pelo armazenamento, transmissão e uso da informação genética. Tipos de ácidos nucleicos: DNA (Ácido Desoxirribonucleico) RNA (Ácido Ribonucleico) Ácidos Nucleicos - Composição Química Os Ácidos Nucleicos são compostos por monômeros denominados nucleotídeos Estrutura de um nucleotídeo: 1 fosfato + 1 pentose´(açúcar) + 1 base nitrogenada. Os Ácidos nucleicos unem-se através de ligações fosfodiéster(Açúcar+fosfato) formando cadeias contendo milhares de nucleotídeos. Bases Nitrogenadas Existem 5 tipos de bases nitrogenadas Adenina, timina, guanina e citosina fica no DNA. Adenina, Uracila, Guanina e Citosina fica no RNA. Bases Nitrogenadas- Classificação As bases nitrogenadas podem ser classificadas quanto ao número de anéis. Serão chamadas de pirimídicas as bases que contém apenas 1 anel em sua estrutura molecular. Serão chamadas de Púricas as bases que contém 2 anéis em sua estrutura molecular. Bases Nitrogenadas- Pareamento das bases nitrogenadas O pareamento das bases nitrogenadas acontece através de ligações de hidrogênio. No DNA funciona da seguinte forma: Adenina com Timina, Citosina com Guanina. No RNA funciona da seguinte forma: Adenina com Uracila, Citosina com Guanina. Pentoses dos Ácidos Nucleicos RNA(ácido ribonucleico)- características Local de produção: núcleo da célula (transcrição) Estrutura: 1 fita(fita simples) Nucleotídeo contendo: Ribose Bases nitrogenadas: uracila, adenina, guanina e citosina. Fosfato RNA(ácido ribonucleico)- Tipos Existem 3 tipos de RNA: RNAm(mensageiro): é o responsável por levar a informação do DNA do núcleo até o citoplasma, onde a proteína será produzida. RNAt(transportador): também é produzido a partir de uma fita do DNA. Esse RNA é assim chamado porque ele é o responsável por transportar os aminoácidos que serão utilizados na formação das proteínas até os ribossomos, onde haverá de fato a síntese das proteínas. RNAr(ribossômico): chamado por alguns de RNA ribossomial, faz parte da constituição dos ribossomos. É nos ribossomos que a sequência de bases do RNA mensageiro é interpretada e a proteína, de fato, sintetizada. DNA(ácido desoxirribonucleico)- forma estrutural É importante observar que há a presença de uma fita dupla(figura A), vale lembrar também que há a presença da timina, as fitas são ligadas por pontes de hidrogênio(figura B), e o DNA tem o formato de dupla hélice(Figura c), por ser contorcido de acordo com a imagem. DNA(ácido desoxirribonucleico)- características Estrutura: 2 fitas unidas por bases nitrogenadas em forma de hélice. Nucleotídeo contendo: Desoxirribose Bases nitrogenadas: Timina, Adenina, Guanina e Citosina Fosfato Relação das bases: A/T= 1; G/C= 1 Quantidade: maior no núcleo/nucleóide(cromatina ou cromossomo), menor no citoplasma(mitocôndrias na célula animal, cloroplastos na célula vegetal). Principais diferenças entre DNA e RNA DNA: Possui fita dupla em sua estrutura, suas bases púricas são a adenina e a guanina, suas bases pirimídicas são a timina e a citosina, sua pentose(seu açúcar) é a desoxrribose e a sua função na célula é armazenar e transmitir as informações genéticas. RNA: Possui fita simples em sua estrutura, suas bases púricas são a adenina e a guanina, suas bases pirimídicas são a uracila e a citosina, sua pentose( seu açúcar) é a ribose e a sua função (do rna) na célula é de fazer a síntese de proteínas(RNAm e RNAt) e de formar os ribossomos(RNAr) . Síntese Proteica- Introdução É importante saber que toda a informação genética dos seres vivos está na molécula de DNA: é o chamado código genético universal. Esse código nada mais é do que combinações entre 3 nucleotídeos do DNA (códon) e aminoácidos provenientes da síntese de proteína realizada pelo ribossomo. Síntese proteica- etapas ETAPA 1: Transcrição A mensagem contida no Gene (porção do DNA que tem a informação genética necessária para a síntese proteica) é transcrita pelo RNAm. Nesse processo, as bases pareiam-se: a adenina do DNA liga-se à uracila do RNA, a timina do DNA com a adenina do RNA, a citosina do DNA com a guanina do RNA, e assim sucessivamente, havendo a intervenção da enzima RNA-polimerase. A sequencia de 3 bases nitrogenadas de RNAm, forma o códon que é responsável pela codificação dos aminoácidos. E assim, a molécula de RNAm replica a mensagem do DNA, migra do núcleo para os ribossomos, atravessando os poros da membrana plasmática, formando assim, um molde para a síntese proteica. Síntese proteica- Etapas Etapa 2: ativação de aminoácidos Nessa etapa, o RNAt vai atuar levando os aminoácidos dispersos no citoplasma, provenientes da digestão, até os ribossomos. Numa das regiões do RNAt estará o anticódon, uma sequência de 3 bases complementares ao códon de RNAm. A ativação dos aminoácidos é dada por enzimas específicas, que unem-se ao RNA transportador, que forma o complexo aa-RNAt, dando origem ao anticódon, um trio de códons complementar aos códons do RNAm. Para que esse processo ocorra é preciso haver energia, que é fornecida pelo ATP. Síntese proteica- etapas Etapa 3: Tradução Na fase de tradução, a mensagem que se encontra no RNAm é decodificada e o ribossomo a utiliza para sintetizar a proteína de acordo com a informação dada. Os ribossomos são formados por duas subunidades. Na subunidade menor, ele faz ligação ao RNAm, na subunidade maior há dois sítios (sítio 1 e sítio 2), onde cada um desses sítios podem se unir a duas moléculas de RNAt. Uma enzima presente na subunidade vai realizar a ligação peptídica entre os aminoácidos, o RNAt voltará ao citoplasma para unir-se a outro aminoácido. Dessa maneira, o ribossomo percorrerá o RNAm, provocando a ligação entre os aminoácidos. O fim deste processo é dado quando o ribossomo passa por um códon de terminação e nenhum RNAt entra no ribossomo, por não existirem mais sequencias complementares aos códons de terminação. Sendo assim, o ribossomo vai se soltar do RNAm, e a proteína específica será formada e liberada do ribossomo. Observação: Para formar uma proteína de 60 aminoácidos, por exemplo, será necessário 1 RNAm, 60 códons (cada um corresponderá a um aminoácido), 180 bases nitrogenadas (cada sequência de 3 bases dará origem a um aminoácido), 1 ribossomo e 60 RNAt (cada RNAt transportará um aminoácido). É possível notar, então, que trata-se de um processo altamente complexo, onde existe a intervenção de vários agentes. Ácidos graxos- O que são? O ácido graxo é um ácido carboxílico(COOH) de cadeia alifática. Eles contém carbono e hidrogênio em suas moléculas. Esses ácidos são produzidos no momento em que as gorduras são quebradas. São pouco solúveis em água (quanto maior a cadeia carbônica, menor a solubilidade), podendo ser usados como fonte de energia pelas células. São encontrados em óleos vegetais e gorduras animais, e são considerados "gorduras boas", por isso devem estar inclusos na dieta alimentar, já que o corpo precisa deles para diversos fins. Dando um maior destaque aos ácidos graxos poliinsaturados ou essenciais que confere ao organismo uma série de benefícios. Ácidos graxos- Classificação Os ácidos graxos são classificados em 3: Saturados: Normalmente são sólidos à temperatura ambiente e as gorduras que contém ácidos graxos saturados são chamadas de gorduras saturadas. Exemplos de alimentos ricos em gorduras saturadas: banha, bacon, toucinho, manteiga, leite integral, creme de leite, ovos, carne vermelha, chocolate e gorduras sólidas. A ingestão excessiva de gordura saturada pode aumentar os níveis de colesterol no sangue, aumentando o risco de desenvolver doença arterial coronariana. Ácidos graxos- Classificação Monoinsaturados: são encontrados em alguns alimentos como abacate, nozes, azeite de oliva e nos óleos de canola e de amendoim. Pesquisas relatam que o consumo de gorduras monoinsaturadas é benéfico na redução do colesterol LDL. Ele é conhecido como "mau" colesterol quando ingeridos em excesso, mas a ingestão equilibrada ajuda a diminuir o risco de se desenvolver doenças cardíacas. Ácidos graxos- Classificação Poliinsaturados: Também conhecidos como essenciais Auxiliam no funcionamento adequado do sistema imunológico É sintetizado por plantas, mas não pelo corpo animal, por este motivo deve ser incluso na alimentação. Há outro ácido graxo conhecido como Omega-9, mas este tipo pode ser facilmente produzido pelo organismo, enquanto os outros dois tipos não são possíveis. Uma alimentação corretamente balanceada deve conter ácidos graxos essenciais que são necessários para manter os níveis saudáveis de lipídios no sangue. Eles também são necessários para uma coagulação sanguínea adequada e para regular a pressão arterial. Outra função importante é o controle de inflamações nos casos de infecção ou lesão. podem ser encontrados em óleo de girassol, óleo de milho, óleo de soja, amêndoas, óleos de peixe e também em oleaginosas como a e a castanha. Lipídios- O que são? Os lipídios, também conhecidos como gorduras, são biomoléculas orgânicas, compostas, especialmente, por moléculas de hidrogênio, oxigênio, carbono e fósforo. São hidrofóbicos, ou seja, insolúveis em água. São solúveis em soventes orgânicos(éter, álcool, benzina, entre outros) Lipídios- funções Os lipídios possuem quatro funções básicas nos organismos: Fornece energia para as células. Porém, estas preferem utilizar primeiramente a energia fornecida pelos glicídios. Alguns tipos de lipídios participam da composição das membranas celulares. Nos animais endodérmicos, atuam como isolantes térmicos. Facilita determinadas reações químicas que ocorrem no organismo dos seres vivos. Possuem esta função os seguintes lipídios: hormônios sexuais, vitaminas lipossolúveis (vitaminas A, K, D e E) e as prostaglandinas. Lipídios- Principais fontes(alimentos) Os lipídios podem ser encontrados nos seguintes alimentos: Margarinas Milho Aveia Soja Gergilim Cevada Trigo integral Centeio Óleo de canola Óleo de soja Óleo de peixes Tecnologia de PCR- O que é? É um método utilizado para a amplificação de fragmentos de uma molécula do DNA em milhares de vezes em algumas horas. Essa técnica causou uma grande revolução nas pesquisas da biologia molecular ao ser descoberta, pois antes desse método ter sido descoberto, o processo de ampificação de pequenas moléculas de DNA, demorava muito mais do que algumas horas. Tecnologia de PCR- O que é? A partir da PCR é possível obter-se cópias de uma parte do material genético em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a sequência que é alvo do estudo. A reação pode ser comporada a uma procura por uma única pessoa em uma grande cidade e cloná-la ao ponto de poder povoar toda a cidade. A reação explora função natural da enzima chamada de taq- polimerases, extraída da bactéria Thermus aquaticus, que é uma enzima termoestável, fato de imensa importância uma vez que a reação se processa em ciclos de diferentes temperaturas, como será dito mais adiante. Tecnologia de PCR- O que é? Este processo de amplificação do DNA foi inventado por Kary Mullis em 1983 e a primeira amplificação feita foi a da betaglobulina humana. Desde então, houve um aumento exponencial no número de publicações científicas que relatavam utilizar a técnica da PCR em experimentos, passando de 3 publicações em 1986 para 1700 em 1990. Esta descoberta condecorou Kary Mullis com o prêmio Nobel de Química dez anos após sua invenção. O fato central que faz a PCR tão útil é que todo organismo vivo possui sequências de nucleotídeos no DNA que são únicas e específicas para cada espécie. Esta reação permite a amplificação de qualquer seqüência de DNA coletada de amostras de materiais biológicos como sangue, urina, outros fluidos corporais, cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de microorganismos, células vegetais ou animais mesmo que com milhares de anos, também podem ser detectadas pela PCR. Para a execução da técnica da PCR é preciso que se tenha conhecimento prévio da seqüência do ácido nucléico que se deseja amplificar, dita "seqüência alvo." A partir disto, desenham-se dois iniciadores ("primers") para dar partida ao processo de síntese em um local específico. Um "primer" serve para sintetizar a seqüência alvo no sentido 3’- 5’e outro para o sentido inverso isto é, 5’-3.’ O "primer" é uma pequena seqüência de nucleotídeos que hibridiza no início da seqüência alvo que se quer amplificar e da qual ele é complementar. Ao reconhecer o "primer," a polimerase sintetiza uma cópia complementar, obedecendo à informação contida na seqüência de DNA queserá replicada (sintetizada). Tecnologia de PCR- Etapas do processo Extração do DNA da amostra que se pretende estudar Purificação do DNA Preparação de uma mistura chamada Master Mix, que conterá todas as substâncias necessárias à sintese de novas cópias de DNA Incubação em um termociclador, que é o aparelho responsável pela execução de todos os ciclos da reação aquecendo e resfriando o/os tubo/s Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos da PCR Revelação e fixação do gel Tecnologia de PCR- Reagentes utilizados Reagentes da PCR: Solução tampão para se garantir pH e concentrações iônicas adequadas à reação Deoxinucleosídeos trifosfatos ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) que atuam como tijolos na construção das moléculas de DNA Os primers A Taq-polimerase H2O Mg+2 para optimizar a reação (nem sempre é usado) O DNA extraído da amostra Alguns adjuvantes quando necessário Tecnologia de PCR- Fases/ciclos Cada ciclo contém um ou mais passos e duas variáveis em cada passo: a temperatura e a duração. Etapa de desnaturação inicial: consiste de um único passo de desnaturação a 94ºC por 5 minutos. Dificilmente altera-se esta etapa. 1)O bojo da PCR toma local neste ciclo, que é subdividido em três:1)Etapa de anelamento; este é o passo que habilita os primers a anelar a fita simples desnaturada. O tempo necessário para anelamento é de 30-45 segundos. 2) Etapa de extensão. É neste passo que a Taq polimerase age para estender o molde. Regularmente ela é realizada a temperatura de 72º (a atividade enzimática ótima é de 76 - 79ºC), dificilmente altera-se a temperatura de 72º. Uma regra para se estimar a extensão do tempo é a de que para cada 1000 nucleotídeos atribuímos 1 minuto. Outra fórmula popular é calcular 60 bases por segundo. 3) Etapa de desnaturação: A desnaturação da molécula de DNA formado serve como molde para o próximo ciclo. Ela é realizada a temperatura de 93-94ºC. Nesta temperatura a enzima tem uma meia vida de cerca de 1 hora. Estes três passos são repetidos 30-40 vezes em particular para análises de digestão. Se os ciclos excederem esta quantidade eles poderão introduzir mutações com a Taq polimerase. Etapa de extensão final. Isto é feito com um único ciclo em dois passos: um passo de anelamento o qual é idêntico ao passo de anelamento na segunda etapa de PCR (mesmo tempo e mesma temperatura). O segundo é a de extensão longa temperatura idêntica ao passo de extensão, porém com duração de 3-5 minutos ( 72ºC) por 5 minutos. Isto habilita toda amplificação semi-iniciada a se completar. Tecnologia de PCR- imagens dos ciclos Tecnologia de PCR- Diferentes aplicações Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros) Seleção de clones recombinantes Sequenciamento direto de produtos amplificados Detecção de mutações em genes específicos Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitas Diagnóstico pré-natal em caso de risco Elucidação de relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico Grande valia na Medicina Forense (impressão digital de DNA) Tecnologia de PCR- Imagem Estudo dirigido feito por: Victória Lopes Trindade Luz Objetivo: ajudar os meus colegas a adquirir um melhor entendimento dos conteúdos que aqui foram apresentados. Obrigada!
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