METODO PCR ELETROFORESE

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BIOLOGIA MOLECULAR_____________________________________________________________2
AULA 4. PROTOCOLO DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Objetivos:
Aplicar a técnica de PCR nas amostras biológicas para testes em biologia molecular.
Fundamentação Teórica: 
Entre 1983 e 1985, Kary Mullis desenvolveu a técnica de amplificação enzimática em cadeia (PCR) que tornou possível amplificar milhões de vezes um fragmento de DNA e assim sintetizar grandes quantidades de DNA . O primeiro passo do PCR é selecionar e sintetizar dois primers (oligonucleótidos monocatenários) com sequência complementar à da extremidade 3´e 5´do DNA em dupla cadeia a amplificar. Cada primer hibridiza somente numa das cadeias e funciona como iniciador da síntese do DNA pelas DNA polimerases, o que significa que os fragmentos de DNA amplificados serão sempre delimitados pelos primers utilizados no PCR. Para além da complementaridade da sequência com as extremidades do DNA alvo a amplificar, os primers são selecionados para que tenham um número de 20-30 nucleotídeos, tenham conteúdo equilibrado de G + C (cerca de 50%), o que determina a sua temperatura de fusão e consequentemente a temperatura de hibridação (annealing) a utilizar no PCR, e sejam específicos na sua amplificação, isto é, determinem somente a amplificação do fragmento de DNA que se pretende e não de outros fragmentos não relacionados.
A seleção dos melhores primers para cada tipo de amplificação pode ser complexa. Por este motivo, recorre-se frequentemente a programas de computador que auxiliam a sua seleção e análise. O programa Oligotech (http://www.oligosetc.com/analysis.php) permite analisar as características estruturais e físico-químicas dos primers, incluindo a temperatura de fusão (Tm), a propensão para formação de estrutura secundária (hairpins) e dimerização. Os dois primers desenhados para uma reação de PCR podem, antes da utilização in vitro, ser testados numa reação de PCR in silico, ou seja online (http://www.in-silico.com/s_PCR_custom/). Este teste online requer apenas a sequência dos primers e do DNA alvo, sequência esta que pode ser obtida, por exemplo, no GENBANK ou outra base de dados equivalente. O resultado obtido no PCR in silico indica se os primers amplificam um só fragmento ou mais do que um (uma medida da sua especificidade relativa) e qual o tamanho dos fragmentos amplificados.
Materiais (Equipamentos e ou Reagentes): 
	Reagente
	1 Reação
	6 Reações
	8 Reações
	10 Reações
	12 Reações
	16 Reações
	20 Reações
	H2O
	9,15
	54,9
	73,2
	91,5
	109,8
	146,4
	183
	Tampão 10 X
	2,5
	15
	20
	25
	30
	40
	50
	MgCℓ2
	1
	6
	8
	10
	12
	16
	20
	CSF
	2,5
	15
	20
	25
	30
	40
	50
	TPOx
	3
	18
	24
	30
	36
	48
	60
	TH01
	3,5
	21
	28
	35
	42
	56
	70
	dNTP
	0,25
	1,5
	2
	2,5
	3
	4
	5
	Taq Polimerase
	0,1
	0,6
	0,8
	1
	1,2
	1,6
	2
	DNA
	3
	—
	—
	—
	—
	—
	—
Pipetas: P10; P20; P 200.
Ponteiras amarelas e brancas.
Termociclador.
Procedimento Metodológico:
O PCR ocorre em ciclos cada um deles com três passos que se processam sequencialmente. Após a leitura o aluno deverá esquematizar os passos descritos e discutir em grupo.
1º passo - O DNA alvo contendo a sequência a amplificar é desnaturado (separação das duas cadeias por quebra das ligações de hidrogénio) por aquecimento a 94-96 °C. 
2º passo - Os primers, normalmente em excesso, ligam-se por complementaridade ao DNA alvo em ambas as cadeias da sequência alvo. O annealing dos primers ao DNA alvo ocorre a uma temperatura relativamente baixa (55-60 °C) que é função do conteúdo em G + C dos primers. 
3º passo – Ocorre a polimerização dos primers e síntese de múltiplas cópias da sequência de DNA alvo Para isso são necessários os quatro dNTPs (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), uma DNA polimerase, o tampão apropriado para a atividade da enzima e a temperatura óptima de funcionamento da enzima. A temperatura óptima de funcionamento da enzima mais utilizada no PCR, a Taq DNA polimerase, isolada da bactéria termófila Thermus aquaticus, é de 72 °C. Estes três passos repetem-se um número limitado de vezes, normalmente 35 vezes ou 35 ciclos, em aparelhos apropriados designados de termocicladores. Teoricamente, 20 ciclos irão produzir cerca de um milhão de cópias da sequência alvo de DNA. Apesar de extremamente eficiente, esta amplificação exponencial das sequências alvo de DNA não é um processo ilimitado. Em condições normais, a atividade da Taq polimerase torna-se limitante após 25-30 ciclos de amplificação.
PARÂMETROS QUE AFETAM AS REAÇÕES DE PCR
COMPONENTES DA REAÇÃO DE PCR
a- DNA polimerase 
Na técnica de PCR só podem ser utilizadas polimerases termoestáveis. As polimerases mais populares são a Taq polimerase da bactéria termófila Thermus aquaticus e a Vent polimerase da bactéria Thermococcus litoralis. Taq DNA polimerase A bactéria Thermus aquaticus vive na água a temperaturas de 75ºC. A sua polimerase, a Taq DNA polimerase, tem uma temperatura óptima de atuação aos 72ºC e é razoavelmente estável a 94ºC. Esta enzima poderá ser adicionada no início da reação e permanecerá ativa durante todos os ciclos de amplificação.
b- Primers
Dos muitos fatores que influenciam a eficiência e a especificidade da reação de amplificação nenhum é mais crucial que o desenho dos primers. O desenho cuidado dos primers é necessário para se obter os produtos desejados em grande quantidade, para suprimir a amplificação de sequências não requeridas e para facilitar a consequente manipulação dos produtos amplificados. Cada primer deve ter 20-30 nucleotídeos de comprimento e conter aproximadamente um nº igual dos quatro dNTPs, com uma distribuição equilibrada de resíduos G e C e uma baixa propensão para formar estruturas secundárias estáveis. 
c- Deoxirribonucleosídios trifosfatados (dNTPs) 
Um PCR padrão contém quantidades equimolares de dATP, dCTP, dGTP e dTTP. São recomendadas concentrações de 200-250 µm de cada dNTP para a Taq polimerase, em reações contendo MgCl2 a 1,5 mM. Concentrações de dNTPs superiores a 4 mM são inibitórias, provavelmente pela captura de íons Mg 2+ que são necessários para a função da enzima. É de salientar, no entanto, pode ser produzida uma quantidade satisfatória do produto de PCR com ≈1kb com concentrações de dNTPs tão baixas como 20 µm a 1 pm. 
d- Cátions divalentes 
Todas as DNA polimerases termoestáveis requerem para a sua atividade cátions divalentes livres, normalmente Mg 2+ Devido à fixação do Mg 2+ pelos dNTPs e primers a concentração molar do cátion deve exceder a concentração molar dos grupos fosfato fornecidos pelos dNTPs e primers. É impossível recomendar uma concentração de Mg 2+ que seja ótima em qualquer circunstância. No entanto, a concentração de 1,5 mM é usada em rotina. A concentração ótima de Mg 2+ deve ser determinada empiricamente para cada combinação de primers e cadeia de DNA. 
e- Tampão 
O tampão é utilizado para manter o pH estável durante a reação. Normalmente utiliza-se o tampão Tris-HCl com o pH ajustado entre 8,3 - 8,8 à temperatura ambiente (TA) a uma concentração de 10 mM. Quando incubado a 72 ºC, temperatura normalmente usada na elongação, o pH da mistura de reação baixa mais de 1 unidade produzindo um pH ≈ 7,2.
f- Cátions monovalentes 
Os tampões de PCR contêm KCl 50 mM e funcionam bem para fragmentos de DNA 
superiores a 500 pb. Aumentando a concentração de KCl para 70-100 mM, em geral, aumenta a eficiência do PCR para fragmentos de DNA curtos.
g- DNA alvo a amplificar 
O DNA alvo a amplificar por PCR pode ser linear ou circular. Cadeias de DNA circular são amplificadas menos eficientemente que cadeias lineares. O tamanho da cadeia de DNA não é crítico. A amplificação de sequências de elevada dimensão (>10Kb) a partir de um DNA circular (ex. plasmídio) pode ser melhorada por linearização do DNA alvo após digestão com uma enzima de restrição que não corte na sequência alvo. Quando optimizado, o PCR requer apenasuma única cópia da sequência alvo. No entanto, é mais frequente haver várias centenas de cópias do DNA alvo na reacção. Para amplificar genes humanos (ou fragmentos de genes) utiliza-se normalmente 1 µg de DNA genómico (existente em cerca de 150000 células) que contém ≈ 3 x105 cópias de um gene autossômico de cópia única. Para DNA de plasmídeos, bactérias, e leveduras usam-se respectivamente 1 pg, 1 ng e 10 ng por reacção de PCR.
PASSOS DA REACÇÃO DE PCR
Desnaturação 
DNAs de cadeia dupla desnaturam a uma temperatura que é determinada em parte pelo seu conteúdo em G + C. Quanto maior for o conteúdo em G + C maior será a temperatura necessária para se separar as duas cadeias da molécula de DNA.Quanto mais longa for a molécula de DNA maior terá que ser o tempo necessário para separar completamente as duas cadeias à temperatura de desnaturação escolhida. Quando a temperatura é reduzida nos dois passos subsequentes do PCR (hibridação e elongação), as cadeias de DNA voltam a ligar-se retomando a sua forma nativa. Em PCRs catalisados pela Taq DNA polimerase a desnaturação ocorre a 94-96 ºC. No 1º ciclo de PCR, a desnaturação ocorre durante 5 minutos para aumentar a probabilidade de total desnaturação de moléculas de DNA longas. Nos ciclos seguintes o tempo de desnaturação pode ser diminuído para 30 seg - 1 min.
Temperatura de hibridação dos primers
A temperatura utilizada para o passo de hibridação é crítica. Se a temperatura é muito elevada, muito próxima ou superior ao Tm dos primers, os primers ligam-se mal ou não se ligam e a amplificação é muito baixa ou inexistente. Se a temperatura é muito baixa, pode ocorrer uma ligação inespecífica dos primers, resultando na amplificação de fragmentos não pretendidos. O annealing é normalmente efectuado 5-10 ºC abaixo da temperatura de fusão (Tm) dos primers. Pode-se melhorar a especificidade do PCR alterando a temperatura de hibridição dos primers em gradientes controlados de temperatura (incrementos sucessivos de 0.5-1 °C).
Elongação
A elongação ocorre à temperatura óptima para a síntese de DNA catalisada pela polimerase termoestável, que no caso da Taq DNA polimerase é de 72-78ºC. Nos dois primeiros ciclos a elongação a partir de um dos primers forma um produto de sequência complementar à cadeia que vai para lá do local de ligação do outro primer. No ciclo seguinte, são produzidas as 1 as moléculas cujo o comprimento é igual ao do segmento de DNA delimitado pelos locais de ligação dos primers. A partir do 3º ciclo, este segmento de DNA é amplificado geometricamente (exponencialmente). No último ciclo de PCR usa-se normalmente um tempo de elongação três vezes superior aos dos ciclos anteriores, para permitir a completa elongação de todas as moléculas amplificadas.
Bibliografia: 
Maristella de Oliveira Azevedo et al.Técnicas de Biologia Molecular. Editora UNB, 2001.
http://www.cstl.nist.gov/strbase/fbicore.htm
http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Butler2006JFS_coreSTRreview.pdf
http://www.ghente.org/ciencia/genetica/mutacao.htm
AULA 5. PROTOCOLO DE ELETROFORESE
Objetivos:
Desenvolver conhecimento técnico de método de separação de moléculas por um campo elétrico através de uma matriz.
Fundamentação Teórica: 
O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, para descrever migração de colóides sob a influência de um campo elétrico. Seu princípio é simples: moléculas de carga negativa migram para o pólo positivo, e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo.
A eletroforese visa à separação de moléculas em função de suas cargas elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações, em suportes porosos (géis) e soluções-tampões (estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo de corrente elétrica). Ou seja, na prática a eletroforese consiste da extração de amostras, seja de proteínas, enzimas ou DNA obtido de um tecido vegetal e da migração destas num gel (amido; agarose, acrilamida) submetido a uma corrente elétrica contínua. O sentido e a velocidade de migração são determinados pelo tamanho e carga das moléculas de DNA ou proteínas. Por exemplo, quanto maior a carga elétrica de uma proteína, mais rápido a sua migração no gel em direção ao eletrodo de carga contrária.
	A passagem de corrente elétrica através de uma solução-tampão segue a Lei de Ohm:
V = R. I
V = voltagem
R= resistência 
I = amperagem
A eletroforese pode ser conduzida ora sob voltagem, ora sob amperagem (corrente) ou, então, wattagem (potência) constantes reguladas pela fonte elétrica. É bom observar que para cada tipo de marcador a ser utilizado diferencia grandemente na corrente elétrica a ser utilizada.
	A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose e géis de agarose, de amido ou de poliacrilamida. Para enzimas, géis de amido e poliacrilamida oferecem melhor separação do que outros suportes. Para marcadores DNA os mais utilizados são géis de agarose e poliacrilamida.
Procedimento:
1. Discutir a técnica;
2. Esquematizar a técnica com exemplos propostos pela professora;
3. Interpretar os dados de resultados propostos pela professora.
Bibliografia: 
Maristella de Oliveira Azevedo et al.Técnicas de Biologia Molecular. Editora UNB, 2001.
Lewontin RC. Twenty-five years ago in Genetics: Electrophoresis in the development of evolutionary genetics: Milestone or Millstone? Genetics, 128:657-662. 1991
Vosberg HP. The polymerase chain reaction: an improved method for the analysis of nucleic acids. Human Genetics, 83:1-15. 1989.