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Diagnóstico imunológico HIV

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HIV
Estrutura do HIV:
Vírus do gênero Lentivirus e da família Retroviridae, tem 2 copias de RNA de cadeia simples
É um vírus encapsulado (proteínas) por capsídeo e tem ainda uma dupla camada externa de fosfolipídios, a qual forma o envelope viral
3 genes principais para suas proteínas estruturais: gag, pol e env
Gag: codifica p55 => proteínas p6, 9, 17 e 24
Proteínas do capsídeo viral: p6, p9 e p24
p17: na membrana interna
pol: codifica p66 e p51 => transcriptase reversa => replicação; p31 => integrase (entre DNA do hospedeiro e do HIV); p10 => clivagem de partículas virais após HIV fazer a lise da célula hospedeira 
env: glicoproteínas gp160, 120 (superfície viral) e 41 (transmembrana) => envelope viral => ligação do HIV nas células do hospedeiro e fusão do envelope com a membrana da célula hospedeira
Similaridade entre HIV 1 e 2 é de 50%
No BR o mais prevalente é o HIV-1 subtipo B, mas no Sul predomina o subtipo C
Infecção e Resposta imune:
Entrada na mucosa do trato genital ou retal na RS => atravessa mucosa e se estabelece no local => infecção de CD4, macrófagos e dendritos
Fase de eclipse: 10d após a infecção, RNA viral não é detectável no plasma
80% das infecções pelo HIV por RS começam por vírus único
Resposta imune inata: ocorre no foco da infecção, atraindo mais linfócitos T, o que aumenta o sitio para replicação viral => disseminação viral (1º linfonodos, depois sistêmica) => produção de vírus no tecido linfoide (vira reservatório em CD4 de memória) => circulação do vírus na corrente sanguínea => pico de viremia 21-28d após a infecção + redução de CD4 => infecção sistêmica => resposta imune tardia e insuficiente => mais produção de CD4 => CD8 tem controle parcial da infecção, porque não são em número suficiente => depleção progressiva e lenta de CD4 => síndrome da imunodeficiência adquirida
Ativação de CD8 ocorre antes da soroconversão 
Resposta imune celular = anticorpos anti-HIV => queda na CV => cronicidade 
Resposta imune humoral: contra gp120, gp41 e p24
IgM: 1º anticorpo produzido => sua presença não permite diferenciar entre doença recente e crônica porque reaparece => desaparecem ou são intermitentes
IgG: elevado por anos
Com o tempo de infecção, os anticorpos produzidos passam a ter maior afinidade ao vírus por mutações ao acaso de hot spots em genes que codificam as Ig
Diagnóstico da infecção pelo HIV:
3G: detectam IgM e IgG
4G: detecção do complexo antígeno-anticorpo + redução da janela diagnóstica => melhor diagnóstico nas infecções recentes 
TM: melhores na confirmação diagnóstica
Controladores de elite: viremia indetectável em TM mas com produção de anticorpos, sendo o diagnóstico obtido por WB, IB ou IBR após IE de 3G ou 4G => 1%
TM não reagente: controladores de elite e não infectados com falso-reagente 
Na fase crônica há a identificação por qualquer teste (95% dos diagnósticos no BR ocorrem nessa fase)
Imunoensaios de triagem:
1G:
Indireto
Presença de anticorpos específicos são detectados por conjugado de anticorpo anti-IgG
Proteínas de células humanas podem ser detectadas junto as virais 
Pouco E e S
Janela de soroconversão: 6-8sem
2G:
Indireto
Usa antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos derivados de proteínas do HIV
Reações antigênicas ocorrem com algumas proteínas de HIV que são alvos específicos na resposta imune humoral
São mais S e E que 1G porque pegam mais proteínas importantes
Janela de soroconversão: 28-30d
3G:
Chamado de sanduíche/imunométrico
Usa antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos em fase sólida e em fase conjugada => detecção de IgM e IgG
IgG é bivalente = 2 sítios de ligação aos antígenos; IgM é penta
Qualquer Ig é detectado
Mais S e E porque antígeno se liga só as partes livres do anticorpo do complexo imune
Janela de soroconversão: 22-25d
4G:
Detectam p24 e anticorpos específicos anti-HIV
Sanduíche => detecta todas Ig com proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos derivados da gp41 e da gp120/160
P24 é detectado como um anticorpo monoclonal de fase sólida 
Janela diangóstica: 15d
TR: detectam anticorpos anti-HIV em 30 min porque consegue acelerar a interação antígeno/anticorpo. Não precisam ser feitos em laboratórios. Podem ser realizados com FO, soro, plasma ou sangue total. E e S de 99%.
* FO tem menos anticorpos que as outras amostras (transferência passiva do sangue circulante), não sendo recomendado se suspeita de infecção recente. Tem janela de soroconversão de 3m. a vantagem é de não ser invasivo e não ter risco biológico, além de ampliar o acesso.
Testes complementares:
WB, IB e LIA (IBR e IFI), além do TM
Bons para confirmação após testes de 4G por detecção de p24
WB e IB usam proteínas nativas do HIV separadas por eletroforese (WB) e transferidas para uma membrana ou proteínas recombinantes/peptídeos sintéticos impregnados diretamente na membrana (IB) => anticorpos da membrana se ligam nas proteínas imobilizadas nas membranas de WB ou IB => anti-HIV detectados por anticorpos secundários + enzima => precipitação colorida no complexo imune 
A maioria detecta apenas IgG e por isso não são recomendados para confirmar a presença de IgM específicos => usar TM 
Diagnóstico por detecção direta do HIV:
Detecção direta de componente do vírus: p24; ou TM, que detecta RNA ou DNA pró-viral
Bons para diagnóstico em <18m e em infecção aguda
TM: diagnóstico precoce da infecção em crianças com exposição perinatal porque elas adquirem passivamente IgG da mãe (inutilizam ensaios baseados em anticorpos), os quais devem desaparecer após 18m
Estagiamento laboratorial da infecção recente pelo HIV: classificação de Fiebig
0: eclipse, ausência de marcadores virais em amostras de sangue. Dura 10d
I: RNA viral é detectável, dura do 7d (mesmo o RNA ficando + para sempre) 
II: RNA viral e p24 reagentes, anticorpos ausentes, dura 5d
III: RNA viral, p24 e 3G (IgM) reagentes, dura 3d
IV: igual ao III + indeterminado em WB (apenas 2 das proteínas são detectadas na banda: p24, gp41, gp120/160), dura 6d
V: igual ao IV mas com WB reagente, ausência de detecção de p31 (gene pol), dura 70d
VI: igual ao V mas com WB completo, aparecendo o p31
* Fiebig não inclui 4G (podem detectar estágios II ou III) e TR
* infecção recente dura 120-180d
* com FO não é possível determinar o Fibig
* problemas: estágios são dependentes da S do ensaio, dependência do fabricante, I-IV tem curta duração, soroconversão pode ser prolongada (3-6m), só pega tipo B do HIV-1
Falhas e erros diagnósticos 
Janela diangóstica
Ocorrência de cepas virais com variações genéticas que não são detectadas pelos testes (HIV 2 e HIV1 grupo O)
Imunosilenciosos: pessoas com níveis baixos ou ausência de anticorpos específicos (são raros)
Infecções sem viremia ou com viremia muito baixa => controladores de elite => não são detectados em TM, mas tem resposta humoral
Falsos reagentes em TR: vacinação contra influenza, artrite reumatoide, colangite, interferon, Stevens-Johnson, infecção viral aguda, aquisição passiva de anti-HIV, tumores malignos, retrovirose, transfusões
Falsos não-reagentes: pessoas em uso de TARV
Fluxogramas de testagem para HIV:
Diagnóstico sorológico é feito com pelo menos 2 testes (1 de triagem e 1 mais específico)
Resultado não reagente é liberado com o 1º teste sendo -. Mas se ainda houver suspeita, pode ser repetido com nova amostra em 30d
Resultado reagente sempre é confirmado com 2º teste diferente do 1º
1º teste deve sempre ser mais S, e o 2º mais E
A S de um fluxograma é igual a S do 1º teste => precisa ser >99,5%
1. 2 TR de fabricantes diferentes
Não define diagnóstico para HIV-2
Se o resultado for reagente nos 2 testes, deverá fazer CV (HIV-1 RNA) + contagem de LTCD4
Não deve ser usado em <18m 
TR2: deve detectar anticorpos anti-HIV1 e 2 
Para ser válido, deve ter linha no C. se inválido, repetir com o mesmo teste, mas com lote diferente
Se resultados de TR1 e 2 forem diferentes, repetir fluxograma. Se ainda for diferente, coletar amostra porpunção
Se CV > 5.000, a infecção é confirmada
Se CV < 5.000, suspeitar de falso-reagente em TR1 e 2 (ou é controlador de elite) => fazer WB, IB ou IBR
2. TR1 – FO + TR2
Não define diagnóstico para HIV-2
Se o resultado for reagente nos 2 testes, deverá fazer CV (HIV-1 RNA) + contagem de LTCD4
Não deve ser usado em <18m 
Vantagem de TR1 não ser invasivo
TR2: deve detectar anticorpos anti-HIV1 e 2 
Para ser válido, deve ter linha no C. se inválido, repetir com o mesmo teste, mas com lote diferente
Se resultados diferentes em TR1-FO e TR2, repetir o fluxograma 
Se CV > 5.000, a infecção é confirmada
Se CV < 5.000, suspeitar de falso-reagente em TR1 e 2 (ou é controlador de elite) => fazer WB, IB ou IBR
3. IE 4G + TM
IE deve detectar: anticorpos anti-HIV-1 e anti-HIV-2 e p24
TM é MAIS S que 4G => reagentes em TR1 e >5.000 cópias indicam infecção; se <5.000 pode ser infecção por HIV-2, TR falso reagente, infecção com TM abaixo do limite de detecção (controladores de elite, uso de TARV) => confirmação com WB, IB ou IBR
Não deve ser usado em <18m 
Tem maior chance de diagnosticar infecção recente
Falsos reagentes têm CV próximas ao limite inferior de detecção do ensaio (suspeitar de controladores de elite) => repetir o teste
Controladores de elite: desenvolvem anticorpos normalmente, mas podem ter TM <5.000 cópias => fazer WB, IB ou IBR
Suspeita de HIV-2: 4G detectam anticorpos anti-HIV-2, mas TM do BR não detectam material nucleico desse vírus => fazer WB, IB ou IBR
Se falso reagente em T1 => fazer WB, IB ou IBR
4. 3G + TM
TM é MAIS S que IE3G
Reagentes em 3G e CV>5.000 = infecção; se reagente em 3G e CV<5.000 = infecção por HIV-2, falso-reagente em T1, controladores de elite, uso de TARV
Não deve ser usado em <18m 
Falsos reagentes tendem a ter número de CV próximas ao limite inferior do detectável no TM
Controladores de elite: desenvolvem anticorpos normalmente, mas podem ter TM <5.000 cópias => fazer WB, IB ou IBR
Suspeita de HIV-2: 4G detectam anticorpos anti-HIV-2, mas TM do BR não detectam material nucleico desse vírus => fazer WB, IB ou IBR
Se falso reagente em T1 => fazer WB, IB ou IBR
5. IE3G + WB/IB/IBR
TM é usado se amostrar com resultados diferentes ou indeterminado 
IE é mais S que testes complementares
Inadequado para <18m
6. IE4G + WB/IB/IBR
Maior chance de ocorrerem resultados discrepantes em infecções recentes
TM deve ser feito quando há resultados diferentes em T1 e T2 ou quando for indeterminado 
Não é adequado para <18m
Estratégias de identificação precoce do HIV em <18m
Passagem de IgG pela placenta no 3ºtri interfere no diagnóstico sorológico de infecção vertical => ficam por 18m => em <18m, é necessário TM com quantificação de CV (RNA viral)
1ª CV deve ser feita com 4sem ou 6sem se ela tiver recebido profilaxia
Se RN sintomático, CV pode ser feita me qualquer momento
Se amamentadas, CV imediatamente
Se 1ª amostra de CV colhida quando >4m, a 2ª deve ser feita com no mínimo 1m de intervalo
CV detectável => repetir com outra amostra novamente => se 2º CV detectável, está infectada
Se 1ª CV for indetectável, repetir aos 4m. se 2º foi também indetectável não está infectada
Documentação de sororreversão em não-infectada: documentada quando >18m e com sorologia –
Pode ocorrer de a criança ter IgG da mãe por 24m (sororrevertores tardios)
Diagnóstico em gestantes: podem predispor falsos-negativos em sorologias, especialmente se tem doenças autoimunes, multíparas, hemodiálise, vacinação, transfusões
Diagnóstico de infecção aguda:
Se houver suspeita clínica, a partir do estágio I pode-se fazer TM para decidir início da TARV
Se > 5.000: soroconversão confirmada após nova amostra ser testada em 30d
<5.000: nova amostra coletada em 7d
Se não for detectado em TM: se houver suspeita, repetir em 7d
Testagem para HIV-2: contato (RS) com países endêmicos, transfusões
Suspeita de HIV-2: CV indetectável com sintomas ou CD4 caindo, T1 reagente e WB/TM não reagente + epidemiologia suspeita, sorologia – mas com suspeita clínica + WB incomum

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