ColoraçaoPapanicolaou

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TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU 
 
 
O método proposto por Papanicolaou, embora não seja insubstituível, tem 
tido grande aceitação em citologia, sendo uma técnica que permite um bom 
detalhamento nuclear e uma boa transparência citoplasmática. 
A coloração de Papanicolaou possui corantes que através de “afinidade 
citoquímica” coram as células, permitindo assim, a visualização de cada camada 
do epitélio pavimentoso estratificado, produzindo uma gama de cores gradual, que 
vai desde o azul mais intenso da camada basal, até o róseo vivo da camada 
superficial. 
A técnica de coloração apresenta as seguintes fases: 
1 – Hidratação 
2 – Coloração nuclear (Hematoxilina de Harris) 
3 – Desidratação 
4 – Coloração citoplasmática (Orange G, EA36) 
5 – Diafanização (Xilol) 
7 – Montagem (Entellan®, Bálsamo do Canadá ou Verniz) 
 É importante ressaltar que o método de Papanicolaou pode sofrer 
pequenas modificações no laboratório em que é aplicado, como o tempo de 
exposição aos corantes, o número de banhos no álcool e no xilol etc. 
 Esta coloração pode ser aplicada pelo método progressivo e regressivo. 
Pelo método progressivo, o corante age sobre as células progressivamente até 
atingir o tom e a intensidade desejada. No método regressivo os núcleos são 
supercorados e o excesso de corante é retirado por meio de um diferenciador. 
 
� Hematoxilina de Harris 
 
É o corante responsável pela coloração dos núcleos das células . 
 Existem várias preparações possíveis e aceitáveis para a hematoxilina, no 
entanto, a mais difundida no método de Papanicolaou é a de Harris. 
A hematoxilina é um corante de curta duração que se oxida com o tempo e 
umidade, e a superoxidação pode ser uma das principais causas da coloração 
fraca dos núcleos celulares. 
Para que a hematoxilina torne-se um corante usável é necessário alguns 
componentes em sua fórmula, como agente oxidante, mordente e solvente. 
O agente oxidante começa o processo de amadurecimento, transformado a 
hematoxilina em hemateína, que é o agente corante ativo. Os agentes oxidantes 
mais freqüentemente usados são o óxido de mercúrio e o iodeto de sódio. 
Para que a hemateína se ligue ao ácido fosfórico da cadeia de DNA do 
núcleo é necessário uma substância de ação mordente, isso porque tanto a 
hemateína, quanto o ácido fósforico possuem cargas negativas. O mordente 
utilizado é o alúmen de potássio, que fornece um íon de carga positiva fazendo 
uma ponte de ligação entre a hemateína e o ácido fosfórico. 
O solvente da hematoxilina é a substância que dissolve a hemateína na 
solução. 
O tempo de exposição do corante é um fator importante para o sucesso do 
método, e a sua contaminação pode resultar em núcleos pálidos. 
Por ser um corante aquoso, o entendimento com os espécimes se dará 
melhor se for realizada a hidratação dos esfregaços antes de serem corados pela 
hematoxilina 
A fraca coloração nuclear também pode ocorrer em esfregaços fixados ao 
ar, excessiva ação do HCl, ou HCl muito concentrado, pH da água não 
suficientemente alcalino ao preparo, corante muito velho e eliminação da etapa de 
hidratação na água destilada, antes da imersão à hematoxilina. 
O hipercromatismo dos núcleos poderá ocorrer por deficiência de fixadores 
que leva à condensação da cromatina, em material fresco que não teve o tempo 
de exposição à hematoxilina reduzido, HCl de baixa concentração ou porções 
espessas do esfregaço. 
 
 
Hematoxilina (cristais)..................... 5,0g 
Álcool absoluto................................ 50,0mL 
Alúmem de Potássio........................ 75,0g 
Óxido amarelo de mercúrio............. 2,0g 
Água destilada................................ 1000,0mL 
 
 Dissolver a hematoxilina no álcool e o alúmem na água, aquecer o alúmem 
sem deixar ferver. Retirar do fogo e misturar as duas soluções. Levar ao fogo até 
ebulição. O tempo de ebulição não deve exceder 1 minuto. 
 Colocar o óxido lentamente (com a solução fora do fogo). Levar o recipiente 
imediatamente a água corrente fria. Quando for usar adicionar 5mL de ácido 
acético para cada 200mL da solução. 
 
 
� Orange G 
 
Trata-se de um corante ácido, que cora queratina e os grânulos de querato 
hialina das células superficiais, com um brilhante intenso alaranjado. 
O Orange G também auxilia no diagnóstico de células malignas que tendem 
a se apresentar orangiófilas de acordo com o seu grau de queratinização. 
O processo de desidratação dos esfregaços é necessário para o 
entendimento com este corante, que está diluído em álcool. 
 
 
Orange..................................... 1,0g 
Ácido fosfotúngstico................. 0,4g 
Ácido acético............................ 3,0mL 
Álcool 95º................................. 380,0mL 
 
 Aqueça o álcool 95ºGL, adicione o laranja G (aos poucos) até que todo o 
corante esteja dissolvido. 
 Filtre. Haverá pequeno depósito de laranja G depois do resfriamento. 
 Adicione ácido fosfotúngstico e o ácido acético na solução filtrada. 
 OBS: Conserve o frasco no escuro. Orange é solúvel em água. 
 
� EA 36 
 
É um corante policromático e alcóolico. É composto pela combinação de 
light green SF yellowish, eosina Y e, em alguns casos, Bismarck brown Y. 
Existem 3 formulações diferentes para o EA: 36, 50 e 65. Sabe-se que o EA 
36, foi originalmente formulado para corar esfregaços ginecológicos, também 
podendo ser utilizado para corar outros tipos de amostras celulares. 
Light green SF yellowish é um corante ácido, que cora de verde o 
citoplasma das células metabólicamente ativas, como as células escamosas 
intermediárias, parabasais, células colunares, histiócitos, leucócitos, células de 
carcinoma de células indiferenciadas e células derivadas de adenocarcinoma. 
A eosina Y é um corante ácido, que cora principalmente o citoplasma de 
células escamosas superficiais, nucléolo e eritrócitos. 
A presença do Bismarck brown Y no EA, é debatida. É sabido que o 
Bismarck Brown Y precipita o ácido fosfotungtico, que é um mordente que se liga 
às proteínas, ajudando na manutenção das cores, serve para fixar o corante a 
uma determinada substância, formando um complexo insolúvel. 
 
 
 
Verde claro (amarelo, verde luz)............................... 2,25g 
Água destilada.......................................................... 100,0mL 
 
Pardo Bismarck (visuvina)........................................ 0,5g 
Álcool absoluto......................................................... 100,0mL 
 
Eosina amarelada.................................................... 2,25g 
Álcool absoluto........................................................ 450,0mL 
 
 Juntar todas as soluções e adicione 10 gotas de carbonato de lítio saturado, 
2,0g de ácido fosfotúngstico. 
 
 
� Xilol 
 
Promove a diafanização das lâminas, deixando as células claras. 
Neste processo pode ocorrer a hidratação do xilol, no qual este se 
apresentará com um aspecto leitoso. 
A hidratação acontece quando há contaminação do álcool. Para corrigir 
essa hidratação, deve-se voltar o carrinho com as lâminas até a segunda cuba de 
álcool após o EA 36, desprezar a cuba de álcool suja, substituir o álcool por álcool 
limpo e colocar esta cuba limpa antes do álcool / xilol. O xilol hidratado deve ser 
desprezado e substituído por outro. Volta-se novamente o carrinho até o último 
xilol. Nunca deve-se montar lâminas hidratadas. 
 
Manutenção da Coloração: 
 
 Os corantes devem ser protegidos da ação de luz (natural ou artificial), e 
periodicamente devem ser filtrados. 
 O álcool deve ser completado e/ou trocado periodicamente. 
 
 
Técnica de coloração de Papanicolaou 
 
1- Álcool a 70% (± 10 minutos) 
2- Água corrente (2 a 3 minutos) 
3- Água acética (5% vinagre / água, 10 minutos)4- Água corrente (10 mergulhos) 
5- Hematoxilina (4 a 5 minutos) 
6- Água corrente (10 mergulhos) 
7- Álcool Hcl 0,1 (rápido) 1L de álcool 70% + 1 mL de HCl PA) 
8- Água corrente (10 a 15 mergulhos) 
9- Água destilada morna ( 8 a 10 minutos e escorre bem) 
10- Álcool 70% (8 a 10 mergulhos) 
11- Álcool 80% (8 a 10 mergulhos) 
12- Álcool absoluto (8 a 10 mergulhos) 
13- Álcool absoluto (8 a 10 mergulhos) 
14- Orange G ( 4 minutos) 
15- Álcool absoluto (8 a 10 mergulhos) 
16- Álcool absoluto (8 a 10 mergulhos) 
17- Álcool absoluto (8 a 10 mergulhos) 
18- EA (2 minutos) 
19- Álcool absoluto (8 a 10 mergulhos) 
20- Álcool absoluto (8 a 10 mergulhos) 
21- Álcool absoluto (8 a 10 mergulhos) 
22- Xilol (8 a 10 mergulhos) 
23- Xilol (8 a 10 mergulhos) 
24- Xilol (8 a 10 mergulhos)