Espermograma Graduaçao

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Elisângela Monteiro Pereira
elimonteirop@gmail.com
Universidade Federal de Alfenas
Aplicações do Espermograma
Avaliação das glândulas seminais Monitoramento pós-vasectomia
Infertilidade
Infertilidade
� Distúrbios hormonais
� Traumas nos testículos
� Problemas congênitos nos testículos
� Medicamentos
� Agrotóxicos
� Irradiação dos testículos
� Distúrbios do sistema imunológico
� Alterações congênitas das vesículas seminais
� Cistos nas vesículas seminais
� Obstruções por malformações congênitas ou por vasectomia
� Varicocele
� Infecções/prostato-vesiculites
� Gonorréia, sífilis, caxumba, etc.
Composição do sêmen
Glândulas sexuais acessórias
• Vesículas seminais
�46 a 80% do volume do sêmen
�Semenogelina e fibronectina: coagulação
�Frutose: fonte de energia
�Prostaglandinas: 13 tipos
�Bicarbonato de sódio
�Potássio
�Glicerilfosforilcolina
�Acetilcarnitina
�Lactoferrina
�Proteínas antigênicas
�Imunoglobulinas
•Próstata
�13 a 23% do volume do sêmen
�pH de 6,5
�Enzimas proteolíticas: fibrinolisina, fibrinogenase, e 
aminopeptidase: liquefação
�Fosfatase ácida e alcalina, alfaglicoronidase, ativador de 
plasminogênio, inibidores de tripsina
�Zinco, cálcio, magnésio,ácido cítrico
�Espermina, espermidina e putrecina: odor
Composição do sêmen
Glândulas sexuais acessórias
•Glândulas bulbouretrais
�Galactose, galactosamina, ácido siálico, ácido 
galacturônico, metilpentose
Composição do sêmen
Glândulas sexuais acessórias
Hormônios
� FSH, LH, Testosterona, Prolactina 
•Espermatozoides
•Células redondas
�Células exfoliação do epitélio germinativo
- Espermatogônias
- Espermátides
- Espermatócitos
- Células de Sertoli
�Leucócitos
Composição do sêmen
Elementos figurados
Dependente de alguns fatores:
• Produção de espermatozoides pelos testículos
• Secreção das glândulas acessórias
• Doenças (febre recente)
• Tempo de abstinência
• Forma de obtenção do ejaculado
Qualidade do sêmen
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Variação no número total e na concentração de espermatozoides de 
cinco indivíduos no período de 1,5 ano
Coleta do sêmen
� Período de abstinência sexual: entre 2 e 7 dias
� Local de coleta: no laboratório ou fora (próximo) do laboratório 
com autorização
� Número de amostras: 3 amostras, espaço mínimo de 2 
semanas entre os testes, no período de 10 a 11 semanas
Vantagens de coleta no laboratório
� não há perda de material durante transporte
� sem variação de temperatura: choque
� observar presença de coagulação
� determinar tempo de liquefação
Coleta do sêmen
- Frasco de coleta: vidro ou polipropileno, boca larga, limpo 
(estéril, nos casos de análise microbiológica);
- Urinar (principalmente para os casos de análise microbiológica);
- Higienização do pênis e das mãos: sabonete neutro e papel 
toalha ou gaze estéril;
- Nome/código do paciente e horário da coleta no frasco;
- Transporte para laboratório: temperatura entre 20ºC e 37ºC.
Coleta do sêmen
Ficha do paciente (formulário)
- Nome/código do paciente
- Data de nascimento
- Período de abstinência
- Data e hora da coleta
- Perda ou não de material durante a coleta
- Dificuldades na obtenção da coleta
- Registrar se a coleta foi realizada fora do laboratório
- Intervalo entre a coleta e a análise da amostra
- Informações adquiridas na anamnese: doenças pregressas e 
atuais, terapia medicamentosa, hábitos esportivos (ciclismo, 
cavalgada), etc.
Análises Macroscópicas
Coagulação
� Proteínas das vesículas seminais
� Coagulação presente / ausente
Liquefação
� Enzimas da próstata
� Liquefação primária: imediatamente após ejaculação
� Liquefação parcial: sêmen parcialmente liquefeito de 
imediato
� Liquefação secundária: até 30 minutos após ejaculação
Viscosidade ou Consistência
� Pipeta sorológica ou bastão de vidro
� Filete de sêmen não deve exceder 2 cm
� Viscosidade aumentada:
o deficiência prostática
o Interfere na determinação da motilidade e da
concentração dos espermatozóides, na detecção de
espermatozóides/anticorpos, na medida de marcadores
bioquímicos.
Como diminuir a viscosidade para continuar as análises?
- Diluir 1:2 em tampão fosfato Dulbecco’s e repetidas; ou
- Com auxílio de seringa, passar o esperma várias vezes através de agulha 
calibre 18 ou calibre 19; ou
- Digestão enzimática com bromelina 10 UI/mL em tampão fosfato Dulbecco’s
(1:2, 37°C, 10 min)
Aspecto:
� HOMOGÊNEO
� Alterações: períodos prolongados de abstinência,
testosterona diminuída, prostaglandinas alteradas, processos
inflamatórios, uso de certos medicamentos.
Coloração
� Branco-opalescente
� Amarelado – leucócitos, medicamentos, abstinência 
prolongada, icterícia
� Avermelhado – hemácias: HEMOSPERMIA
� Menos opaco – concentração espermática baixa
Odor
Sui generis – suco de castanhas, hipoclorito diluído.
Volume
� Pesagem do frasco antes da coleta e após, contendo a 
amostra;
� Tubo de centrífuga graduado
� Valor de referência: ≥ 1,5 mL
� Valores abaixo do normal: HIPOSPERMIA (perda da amostra durante 
a coleta, ejaculação retrógrada parcial, deficiência androgênica, obstrução do ducto 
ejaculador, ausência bilateral congênita dos canais deferentes, vesículas seminais deficientes. 
Ausência de ejaculado: ASPERMIA 
pH
Secreção vesicular seminal
ALCALINA
Secreção prostática
ÁCIDA
� Fita medidora de pH (variação de 6 a 10);
� pHmetro para amostras viscosas;
� Após liquefação (em até 30 min, máximo 1h) 
� Valor de referência: ≥ 7,2
� pH < 7,0 em amostra com volume baixo e número de 
espermatozoides diminuídos – obstrução do ducto 
ejaculatório ou ausência bilateral congênita dos canais 
deferentes ou deficiência das vesículas seminais.
� pH alto – pouca informação clínica.
Análises Microscópicas
Análises Microscópicas
� Análise inicial: lâmina / lamínula ou câmara
� Presença de células redondas
� Presença de muco
� Agregação dos espermatozóides
� Aglutinação dos espermatozóides
� Motilidade
� Determinação da diluição para contagens celulares
� Tempo: logo após liquefação (30 min, máximo 1h)
� Volume da amostra e dimensões da lamínula
Padronização: D (“depth” - espessura) ≅ 20 µm
D = V(µL) /A(mm2)
10 µL semêm / lamínula 22x22mm = 20,7 µm (D)
6,5 µL semêm / lamínula 18x18mm = 20,1 µm (D)
Análises Microscópicas
� Microscópio de contraste de fase – 200x ou 400x
� Homogeneidade da amostra – distribuição uniforme dos 
espermatozoides
Interferentes:
� Ausência ou má homogeneização prévia da amostra;
� Liquefação/viscosidade anormal; 
� Agregação de espermatozoides;
� Aglutinação de espermatozoides.
� Replicatas
Agregação
� Aderência de espermatozoides imóveis entre si, a muco, a 
células redondas ou a debris.
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Agregados de espermatozóides com:
(a) células epiteliais
(b) debris
(c, d) espermatozóides
Aglutinação
� Aderência de espermatozoides móveis entre si:
� Cabeça-Cabeça
� Calda-Calda
� Mista
� Sugere anticorpos anti-espermatozoides;
� A presença de muitos aglutinados inviabiliza a determinação 
da motilidade e da concentração espermática.
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Motilidade
- PR = Motilidade Progressiva : movimento ativo linear ou em 
grandes círculos
- NP = Motilidade Não Progressiva : padrões de motilidade com 
ausência de progressão (ex. movimentoem pequenos círculos, 
ou força flagelar com difícil deslocamento da cabeça, ou quando 
somente o movimento flagelar é observado)
- IM = Imóveis
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Valores de Referência
PR + NP ≥ 40%; PR ≥ 32% 
Valores abaixo do normal: ASTENOZOOSPERMIA
� Área definida (5 mm da borda), campo aleatório;
� Retículo na ocular facilita o processo 
� Leitura: 200 espermatozoides intactos, por replicata;
� Sequência: PR – NP – IM 
� Resultado: % (média das replicatas) de cada categoria
Motilidade
� Comparação das replicatas:
Motilidade
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
� Comparação das replicatas:
Motilidade
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Exercício 1:
PR: (a)30% (b)50%
NP: (a) 5% (b)15%
IM: (a)65% (b)35%
Exercício 2:
PR: (a)37% (b)28%
NP: (a) 3% (b) 6%
IM: (a)60% (b)66%
Motilidade
� Análise seminal computadorizada (CASA): Identifica e
acompanha o traçado individual dos espermatozoides e
calcula parâmetros que caracterizam a cinemática da
movimentação do espermatozoide.
Vitalidade
� Espermatozoide vivo – membrana celular íntegra:
� análise por exclusão de corante
eosina-nigrosina
eosina
� análise do inchaço hipoosmótico
solução hipotônica de citrato de sódio e frutose
� Valor de referência: 
≥ 58% de espermatozóides com membrana celular íntegra
� Valores abaixo do normal: NECROZOOSPERMIA
Eosina-Nigrosina
Teste do inchaço hipoosmótico
Representação esquemática das mudanças na morfologia dos espermatozoides
(a) Nenhuma alteração morfológica
(b) – (g) Mudanças na calda
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
� Concentração de espermatozoides 
� Número de espermatozoides/volume de esperma;
� Relação com fertilização e taxa de gravidez;
� Influência do volume de secreção prostática e de secreção 
vesicular seminal;
� Não é um medidor específico da função testicular.
� Número de espermatozoides no esperma
� Número total de espermatozoides no ejaculado inteiro:
Concentração de espermatozoides X Volume de esperma
� Relação com o volume testicular (em curto tempo de abstinência e 
em aparelhos reprodutores sem obstrução)
� Medidor da capacidade dos testículos produzirem 
espermatozoides.
Contagem de Espermatozoides
� Hemocitômetro - Câmara de Neubauer improved
� Diluição em solução diluente (fixadora) ou água
Pré-determinada pela análise do esperma não diluído entre lâmina e lamínula.
� Aumento de 400x
Contagem de Espermatozóides
Determinação da diluição
Contagem de Espermatozóides
� Número de espermatozoides por campo de alta potência
(HPF: high-power field) 
Volume observado por HPF para uma espessura de 20µm da amostra entre 
lâmina e lamínula:
� Objetiva 40X; Ocular 10X com abertura de 20 mm = 4nL
� Objetiva 20X; Ocular 10X com abertura de 20 mm = 16nL WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Contagem de Espermatozoides
� Método convencional:
C = Nx5x10xFDx1000, onde:
C = concentração (nº de espermatozoides/mL)
N= nº de espermatozoides contados na câmara
5 = A área da câmara destinada à contagem de hemácias
tem 0,1 cm3 de capacidade e é dividida em a25 quadrados
que por sua vez se dividem em 16 quadradinhos. Como nós
efetuamos a contagem em apenas 5 dos 25 quadrados
(apenas 1/5 da área) deveremos fazer a correção para
achar o nº de espermatozoides contidos em toda área de
0,1mm3. Portanto, se contamos em apenas 1/5 da área
deveremos multiplicar por 5 para achar o nº total de
espermatozoides contidos em toda a área.
10 = transformação de 0,1mm3 em 1mm3.
FD = Fator de diluição do esperma
1000 = transformação de 1mm3em 1cm3/mL
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Contagem nas linhas das grades:
� 5 : para amostras diluídas 1:20 e 1:5;
� 4 e 6 : quando necessário, para amostras diluídas 1:20 e 1:5;
� Contar 200 espermatozoides no mínimo, por contagem (replicata);
� Contar linhas inteiras. Número de linhas igual entre as contagens.
C = (N/n) x (1/20) x FD
N = número de espermatozoides
n = número total de linhas examinadas
20 = volume das linhas examinadas (20 nL para grades 4, 5 e 6)
FD = fator de diluição
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Diferenças aceitáveis entre as contagens (replicatas)
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Exercício 3:
Diluição da amostra: 1:20
Contagem 1: 201 espermatozoides, 7 linhas
Contagem 2: 245 espermatozoides, 7 linhas
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Exercício 4:
Diluição da amostra: 1:20
Contagem 1: 220 espermatozoides, 4 linhas
Contagem 2: 218 espermatozoides, 4 linhas
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Exercício 5:
Diluição da amostra: 1:20
Contagem 1: 98 espermatozoides, 15 linhas
Contagem 2: 114 espermatozoides, 15 linhas
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Exercício 6:
Diluição da amostra: 1:5
Contagem 1: 224 espermatozoides, 4 linhas
Contagem 2: 268 espermatozoides, 4 linhas
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Exercício 7:
Diluição da amostra: 1:5
Contagem 1: 224 espermatozoides, 8 linhas
Contagem 2: 213 espermatozoides, 8 linhas
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Contagem nas linhas das grades:
� 1 a 9 : para amostras diluídas 1:2.
� Contar 200 espermatozoides no mínimo, por contagem (replicata);
� Contar grades inteiras. Número de grades igual entre as contagens.
C = (N/n) x (1/100) x FD
N = número de espermatozoides
n = número total de grades examinadas
100 = volume das grades examinadas 
FD = fator de diluição
Para amostras com baixa concentração de espermatozoides
Sensibilidade do método:
25 espermatozoides/câmara
< 56000/mL
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Diferenças aceitáveis entre as contagens (replicatas)
Para amostras com baixa concentração de espermatozoides
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Exercício 8:
Diluição da amostra: 1:2
Contagem 1: 200 espermatozoides, 2 grades
Contagem 2: 250 espermatozoides, 2 grades
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Exercício 9:
Diluição da amostra: 1:2
Contagem 1: 210 espermatozoides, 3 grades
Contagem 2: 200 espermatozoides, 3 grades
Contagem de Espermatozoides
� Método WHS, 2010:
Exercício 10:
Diluição da amostra: 1:2
Contagem 1: 10 espermatozoides, 9 grades
Contagem 2: 8 espermatozoides, 9 grades
Valores de Referência
� Concentração de espermatozoides:
≥ 15,0 x 106 espermatozoides/mL
� valor abaixo do normal: OLIGOZOOSPERMIA
� ausência de espermatozoides: AZOOSPERMIA
� Número total de espermatozoides no ejaculado :
concentração x volume da amostra
≥ 39,9 x 106 espermatozoides no ejaculado
Contagem de Espermatozoides
� Células germinativas imaturas
� Espermátides, espermatócitos, espermatogônias
� Indicam lesão testicular
� Células de Sertoli
� Indicam lesão testicular
� Tufos ciliares
� Indicam patologia dos ductos eferentes
� Leucócitos
� Indicam inflamação
Células Redondas
� Câmara Neubauer improved – método convencional
�WHS, 2010. – Esfregaços corados
C = S x (N/400)
C = Concentração de células redondas
S = Concentração de espermatozoides
N = Número de células redondas contados no mesmo número de campos com 400 
espermatozoides
� Valores de referência: < 5,0x106 células redondas/mL
< 1,0 x106 neutrófilos/mL
Contagem de Células 
Redondas
� Diferenciaçãodos leucócitos: infecção no trato genital
� método histoquímico: benzidina-cianosina
� método imunocitoquímico: Ac monoclonal
� neutrófilos >1,0x106/ mL: LEUCOCITOSPERMIA
Contagem de Células 
Redondas
� Difícil sem coloração
� Métodos de coloração:
Papanicolaou, Bryan-Leishman, Shorr, Giemsa, Diff-Quick
� Análise morfológica:
Aumento 1000x – óleo de imersão
200 espermatozoides no mínimo, por contagem (replicata)
Morfologia
Classificação quanto ao Critério Estrito
Forma normal:
�oval
� segmento cefálico:
5 - 6 µm comprimento; 2,5 - 3,5 µm largura
� acrossomo: 40-70% do segmento cefálico
� peça intermediária normal
� cauda: 45 µm comprimento
Valor de Referência
Espermatozoides normais ≥ 4%
Morfologia
(a, b) Espermatozoides colhidos da zona pelúcida in vitro (coloração de Shorr)
(c) Espermatozoides colhidos do muco endocervical, após intercurso (Papanicolaou)
WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Janini & Pereira, 2001.
Espermatozóides Anormais
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Espermatozóides Anormais
Defeitos de segmento cefálico:
� macrocéfalo
� microcéfalo
� fusiforme
� piriforme
� bicéfalo
� acéfalo
� amorfo
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Espermatozóides Anormais
Defeitos de peça intermediária:
� espessa / fina
� gota citoplasmática
� quebrada
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Espermatozóides Anormais
Defeitos de cauda:
� curta
� enrolada
� múltipla
Janini & Pereira, 2001.
Janini & Pereira, 2001.
Diferença entre Critério Estrito 
Todas as formas “borderline” são consideradas 
anormais pelo Critério Estrito
Valores de referência:
Critério estrito: ≥ 4% ovais normais
Valores abaixo do normal: TERATOZOOSPERMIA
Morfologia
Células Redondas
� Espermatogônias
� Espermatócitos
� Espermátides
Morfologia
Espermatogônias
� redondas;
� medem em torno de 12 µm;
� citoplasma basófilo, de cor escura;
� núcleo único e homogêneo, grânulos de cromatina finos e 
intensamente corados;
� halo perinuclear.
Espermatócitos primários
Meiose
� células grandes;
� citoplasma irregular, às vezes ovalada, outras vezes em meia lua ou em 
forma de trevo. Os bordos não são bem definidos;
� citoplasma finamente granulado, às vezes vaculolizado;
� presença de zona clara adjacente ao núcleo, contratando com o resto do 
citoplasma;
� núcleo grande (11 µm), cromatina filamentosa e presença de 1 ou 2 
nucléolos.
Espermatócitos secundários
� células redondas e pequenas;
� núcleo central, grande e condensado.
Espermátides
� células polimorfas: arredondadas, ovaladas ou alongadas
� diâmetro entre 6 e 12 µm;
� o núcleo central ou periférico (4,5 – 6 µm), cromatina condensada;
� núcleo único ou multinucleação (núcleos grupados, com localização 
periférica na célula);
� citoplasma apresenta-se bem corado, claro e homogêneo com 
vacúolos pequenos, isolados ou formando pequenos a grupamentos.
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
WHO Laboratory Manual for the Examination and
Processing of Human Semen, 5ª.ed, 2010.
Células de Sertoli
� São raras, possuem formas prismáticas, alongadas, fusiformes,
raramente ovais (20 a 40 µm);
� Núcleo grande, irregular, em meia-lua, raramente oval, sempre
apresentando nucléolo, com tamanho variando entre 10 e 20 µm;
� Citoplasma cianofílico, abundante, muitas vezes sem delimitações.
Morfologia
Exercício 11:
200 espermatozoides por contagem
Contagem 1 – 18% espermatozoides normais
Contagem 2 – 9% espermatozoides normais
Morfologia
Exercício 12:
200 espermatozoides
Contagem 1 – 10% espermatozoides normais
Contagem 2 – 14% espermatozoides normais
Análises Bioquímicas
� pH: 7,2
� marcadores de próstata:
zinco: 100 - 200 µg/mL
fosfatase ácida: 200 U por ejaculado ou mais
ácido cítrico: 200-800 mg/dL
� marcador das vesículas seminais:
frutose:100 – 350mg/dL
� marcador de epidídimo:
alfaglucosidase
Testes para detecção de anticorpos anti-
espermatozóides no esperma
� Mar Test (reação mista) IgG e IgA
� Teste immunobead: IgG, IgA e IgM
� Teste de aglutinação em tubolâmina ou Franklin e Dukes
� Teste de imobilização ou Isojima
� Teste de aglutinação macroscópica em gelatina ou teste de
Kibrick
� Anticorpos anti-espermatozóides séricos (no homem e na
mulher)
Análises Imunológicas
Cultura e Bacterioscopia
� Orientação aos pacientes:
urinar antes da colheita
lavar as mãos e o pênis
� Frasco estéril
� Cultura para bactérias
LAUDO
Referências Bibliográficas:
1.JANINE, J.B.M; PEREIRA, O.S. Atlas de Morfologia
Espermática. São Paulo: Atheneu, 2001.
2.STRASINGER, S.K. Uroanálise e Fuidos
Biológicos. 3ª ed. São Paulo: Premier, 1998.
3.HALL, J.E.; GUYTON, A.C. Tratado de Fisiologia
Médica. 11ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2006.
4.Word Health Organization. WHO Laboratory Manual
for the Examination and processing of human sêmen.
Fifth edition, 2010.