Resumo Enzimas

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Enzimas
CatalisadoresbiológicosAs enzimas são catalisadores biológicos pertencentes ao grupo das proteínas. As
enzimas são moléculas extremamente especializadas, que se ligam a substratosespecíficos e aumentam a velocidade de sua conversão em determinado produto. O
aumento da velocidade da reação proporcionado pela enzima ocorre peladiminuição da sua energia de ativação. O catalisador participa efetivamente da
reação, sofrendo alterações em sua estrutura química durante o processo, mas,invariavelmente, retorna à sua forma original ao fim da reação e pode ser utilizado
novamente.Além das enzimas, também são catalisadores biológicos as ribozimas,
pertencentes ao grupo dos ácidos nucleicos. As ribozimassão encontradasem menorfrequência e, geralmente, catalisam reações de hidrólise ou formação de ligações
fosfodiéster.Embora com característicasestruturaisdistintas, enzimase ribozimasatuam sobre
substratos específicos, convertendo-os em produtos. De maneira geral, para que areação catalisada ocorra são requeridas condições adequadas de pH, pressão,temperaturaemeioaquoso.
Importância dasenzimas
As enzimassão importantes para o entendimento de como as célulassobreviveme se proliferam, pois são responsáveis pela catálise de centenas de reações
metabólicas, que fazem partedo funcionamento do organismo.O estudo das enzimas também é importante para o entendimento de certas
doençase parao seu diagnóstico. Oalbinismo, por exemplo, é caracterizado pela faltada enzima tirosinase, que catalisa a conversão da tirosina em melanina, proteína que
dá cor à pele. Outro exemplo são as enzimas transaminases glu-oxalacetato (TGO) eglu-piruvato (TGP), usadas em diagnósticos cardiológicos e hepáticos. Alterações no
fígado proporcionam o aumento do TGPem relação ao TGO; o infar to no miocárdioprovoca o aumento na concentração de TGO.
Sítio ativo ou sítio catalíticoAs enzimas apresentam uma região específica (domínio) representada por uma
fendana qual o substrato liga-se em condiçõesambientais adequadas. Essa região édenominada sítio ativo ou catalítico. Bioquimicamente, as cadeias laterais dos
resíduosdos aminoácidos presentes no sítio ativo permitem uma interação específicacom o substrato, posicionando-o e ligando-o à estrutura tridimensional do sítio
catalítico. Em outras palavras, a interação de determinado substrato com a enzimadependerá de suas características físico-químicas, bem como da carga resultante dos
resíduosde aminoácidos localizadosno sítio ativo. Além da interação como substrato,
os aminoácidos presentes no sítio ativo participamdiretamente das reações químicas
que culminamna conversão do substrato em produto.Enzimase pH
A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para o qual a sua atividade émáxima. A influência do pH pode ser compreendida pelo fato de alguns aminoácidosapresentarem grupos ionizáveis, que podem fazer parte do sítio ativo ou serem
importantes na manutenção da estrutura espacial da molécula. Existe umaconcentração hidrogeniônica que propicia um determinado arranjo de grupos
protonados e desprotonadosque leva amoléculade enzima à conformação ideal paraexercer seu papel catalítico.
Enzimase temperatura
A velocidade das reaçõesenzimáticasé favorecidapelo aumento da temperaturaenquanto a enzima conservar sua conformação. A perda da sua estrutura ocorre
normalmenteentre 50 e 55º C
Enzimase concentração desubstrato
A velocidade das reações enzimáticas depende também da concentração dosubstrato no meio celular. Aumentando a concentração do substrato, há o aumento
respectivo da velocidade da reação, até um ponto máximo para uma reaçãoespecífica. A partir desse ponto, o aumento da concentração não modifica a
velocidade, pois as enzimas já estão todas sendo utilizadas na maior velocidadepossível. Nesse caso, diz-se que asenzimasestão saturadas.
Classificação dasenzimas
Asenzimassão classificadasde acordocom asua função.
1) Oxirredutases: transferência deelétrons.
2) Transferases: reação de transferênciade grupos.
3) Hidrolases: reaçõesde hidrólise (transferênciade grupos funcionaisparaágua).
4) Liases: adição de grupos em ligações duplas ou formação de ligações duplaspela remoção de grupos.
5) Isomerses: transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar
isômeros.
6) Ligases: formação de ligações pelo acoplamento e clivagem do ATP comreaçõesde condensação.
Nesse sistemade classificação são atribuídosnúmerospara cadaclasse, subclasse
e subsubclasse de enzimas de acordo com a natureza de sua reação catalítica, e os
grupos de espéciesquímicasque fazem parte da reação, como doadorese aceptores,
se for o caso. Essenúmeroé conhecido como EC(do inglêsenzyme comission number).A enzima hexocinase, por exemplo, possuio ECnumber 2.7.1.1. Anatureza da reação
que ela catalisa é de fosforilação, ou seja, transferência de um grupo fosfato do ATP(trifosfato de adenosina) paraumamoléculade glicose, seu substrato. Por isso, aela é
atribuída a classe das transferases, de número 2. Como ela transfere um grupocontendo fósforo, seu ECnumber prossegue com o número 7. Oaceptor desse grupo
fosfato é uma hidroxila presente na glicose, o que confere à hexocinase o número2.7.1. Por fim,o número1 final é atribuído a enzimasque transferemum grupo fosfato
paramoléculasde açúcar com seisátomos de carbono.
Cofatores
Algumas enzimas requerem, além do substrato, a presença de cofatores paracatalisar a reação. Os cofatores podem ser orgânicos, sendo chamados também de
coenzimas, ou inorgânicos.Os cofatores inorgânicos são normalmente íons metálicos. Por exemplo, na via
glicolítica, a transformação de glicose e ATP em glicose-6-fosfato e ADP é catalisadapela enzima hexoquinase. Porém, paraque essa reação ocorra, é preciso que existam
íons Mg2+, que atenuam a carga negativa do ATP para evitar a repulsão entre essamoléculaea enzima.
As coenzimas são cofatores orgânicos. Durante a catálise, coenzima e substratoacham-se alojados no sítio ativo da enzima, consistindo a reação na remoção de
determinado grupo químicodo substrato e sua transferência paraacoenzima, ou vice-versa. Vê-se, portanto, que as coenzimas não apenas sofrem modificações em sua
estrutura ao participarem de uma reação enzimática, mas são necessárias para aocorrênciada reação.
O substrato, diferentemente da coenzima, sofre alterações nas reaçõesmetabólicassubsequentes, enquanto a coenzima, atravésde outra reação, volta à sua
forma original. A reação que modifica e a reação que restaura a coenzima sãocatalisadaspor enzimasdiferenteseespecíficas.
Um exemplo de coenzimaé o NAD+, que participada transformaçãode lactato empiruvato. ONAD+ captura umH, transformando-se emNADH.É preciso fazer a distinção entre coenzima e grupo prostético. A coenzima está
fracamente ligadaà enzima, ao passo que o grupo prostético está for temente ligado aela. O grupo heme da hemoglobina, por exemplo, é um grupo prostético, que se liga
não-covalentemente àscadeiaspolipeptídicas.Também é preciso fazer a distinção entre coenzimas e vitaminas. Há vitaminas
lipossolúveis, como A, Ee K, e vitaminashidrossolúveis, como BeC. Muitascoenzimassão derivadasde vitaminashidrossolúveis.
Regulação enzimática
As enzimas atuam catalisando reações sequenciais, nas quais o produto de uma
reação é o substrato da reação subsequente. Avelocidade dessascascatasde reaçõesé controlada por uma ou maisenzimas chamadas enzimas regulatórias, as quais são
cruciais para regular o metabolismo. A eficiência e a importância das enzimas fazemcom que as células necessitem regulá-las de maneira extremamente refinada para
garantir sua homeostasia.
 Regulação daatividadeenzimática
o Regulação alostérica
As enzimasque funcionam atravésde ligação não-covalente e reversível com ummetabóli to são denominadas enzimas alostéricas. Essas enzimas moduladasalostericamente, obrigatoriamente, apresentam estrutura quaternária e um segundo
sítio não catalítico, no qual moléculas pequenas interagem e alteram a conformaçãotridimensional
da enzima, afetando, consequentemente, sua atividade catalítica. As
enzimas alostéricas são, portanto, aquelas que podem adotar duas ou maisconformações ligeiramente diferentes e, com a passagem de uma delas para outra, a
atividadeenzimáticaé alterada.A ligação dosmoduladoresno sítio alostéricoafetade formaprofunda a atividade
enzimática, que pode ser aumentada ou diminuída. Quando a ligação do moduladorpromove um aumento da atividade enzimática, ele é chamado de moduladoralostérico positivo. Porém, quando a ligação do modulador leva a uma diminuição daatividadeenzimática, ele é chamado demodulador alostériconegativo.
Nas vias metabólicas, é frequente que o produto final atue como efetuadoralostérico negativo de uma enzima alostéricaque catalisaumasdas primeirasreações
da via. Quando aumenta a concentração celular deste produto, sua atuação comoinibidor alostérico fazdiminuir avelocidade da via, restringindo sua própriaprodução.
Este é o mecanismo de feedback ou retroalimentação. À medida que o metabóli to éconsumido por outrassequênciase sua concentração diminui, percentuaiscrescentes
de enzima voltam à forma ativa, aumentando a velocidade da via. Note que alocalização da enzima reguladora em uma etapa inicial da via é estratégica,
consti tuindo um fator de economia celular, impedindo o acúmulo de intermediáriosque poderiam interferir de modo negativo sobre outrasvias. Muitasvezes, o produtofinal de uma via atua também como efetuador alostérico positivo em uma outa via
metabólicaque utilizaomesmo substrato inicial.
Observaçõesdenomenclatura
 Ativador (para enzima terciária) ≠ modulador ou efetor (para enzimaquaternária)
 Km (paraenzima terciária) ≠ K0,5 (paraenzimaquaternária).
o Regulação pormodulação covalenteA ligação de grupamentos químicos como fosfato, metil, adenil, uridil e ADP-
ribosil a resíduos de aminoácidos específicos da enzima pode alterar positiva ounegativamente a atividade catalítica, principalmente por causa de sua influência na
conformação resultante da enzima.Por meiodessamodulação, enzimas inativas, apósumacascatade reações, transforma-senaenzima ativa.Por exemplo, a síntese e a degradação de glicose no sangue ocorre através de
uma regulação por modulação covalente, onde enzimas inativas são ativadas, porfosforilação, em uma cadeia de reações em cascata, até que uma enzima ativada
degrada glicogênio em glicose. A coagulação do sangue também ocorre através deuma sériede reações emcascata, até que, finalmente a trombina (ativada) converte o
fibrinogênio em fibrina.
 Regulação dasíntese enzimáticaEnzimas induzidas são enzimas que ocorrem no organismo, em pequenas
quantidades, e tem assuas sínteses aumentadaspor indução. Por exemplo, a bactériaE. coli necessita de glicose como fonte de carbono. Se a glicose for substi tuída por
lactose, a bactéria inicialmente não crescerá, mas sim apenas após certo tempo,necessário para que a produção da enzima beta-galactosidase seja induzida. O
processo de indução se inicia com a produção de um repressor ativo pela regiãoindutora do DNA (após a transcrição em RNA e tradução). Será produzido depoisum
indutor que inativará o repressor, o qual deixará de se ligar ao operador, permitindo asíntese de beta-galactosidase.
Cinética dasreações
A velocidade da reação é explicada pela teoria das colisões. Essa teoria
estabelece que, para reagir, as moléculas presentes em uma solução devem colidircom orientação apropriada e que a colisão deve levá-lasa adquirir uma quantidade
mínimade energiaque lhes permitaatingir um estado reativo, chamado de estado detransição. Para levar todas asmoléculasde um mol de uma substância até o estado
de transição necessita-se de uma quantidade de energia definida como energia deativação. Esta energia é, portanto, a barreira que separa osreagentes dosprodutos.
Avelocidade deumareação será diretamente proporcional ao número demoléculascomenergia igual oumaior do queaenergiado estado de transição.
Fatoresque alteramavelocidade dareação
1) Concentração de substrato eenzima
Quando se adiciona enzima a uma solução de substrato, ocorre um equil íbrioentre as concentrações de enzima (E), substrato (S) e do complexo enzima-substrato
(ES), que posteriormente formará o produto:
Retomando a equação que descreve a velocidade da reação em função daconcentração de substrato, observa-se que, à medida que a reação ocorre, a
concentração de substrato diminui. Assim, é complicado estudar os efeitos daconcentração de substrato, já que esse valor variaao longo da reação. Umamaneirade simplificar isso é medindo a velocidade inicial da reação designada por Vo. Em um
experimento cinético a [S] é, sempre, muito maior que a [E], por tanto, se o tempo dereação for suficientemente curto, asmudanças em [S] serão desprezíveise esse valor
poderá ser entendido como umaconstante.
Em [S] pequenas, a Vo aumenta quase linearmente e a maior parte das enzimas
encontram-se em sua forma livre, isto é, não ligada ao substrato. Quando aquantidade de substrato presente é tão alta que desloca o equilíbrio quase
completamente no sentido de formação de ES, praticamente todaa enzimadisponívelencontra-se complexada com o substrato. Nessas condições, a velocidade deformação do produto é máxima (Vmáx), já que a concentração do reagente nessecaso (ES) é tambémmáxima.
Pode-se observar claramente que, conforme a concentração de substrato cresce,a velocidade de reação também aumenta, até um ponto em que ocorre uma inflexão
na curva e novas adiçõesde substrato têm um efeito cada vezmenor no aumento davelocidade.
Um ponto muito importante no gráfico é aquele no qual a concentração de
substrato resulta numa velocidade de reação igual à metade da velocidademáximapossível. Essa concentração de substrato equivale à constante de Michaelis-Menten
(KM). Seu valor indica a afinidade que uma enzima apresenta por seu substrato.Quantomenor o valor deKM, maior a afinidadedaenzimapelo substrato.Da mesma forma que a velocidade da reação é diretamente proporcional àconcentração de substrato, ela também é diretamente proporcional à concentração
de enzima.Como pode-se observar na figura acima, a descrição gráfica da cinética de uma
reação enzimática corresponde a uma curva hiperbólica que se aproximaassintoticamente do valor de Vmáx. Para obter o valor de KM, é preciso uma boaaproximação de Vmáx, muitas vezes impossível de se obter com concentrações emcondições normais de laboratório. Por isso, Lineweaver e Burk (1934) modificaram a
equação de Michaelis-Menten de formaa transformá-la numa equação que descreveuma reta do tipo y = ax + b, facili tando, assim, a obtenção do valor de KM a partir dacurva traçada, independente daobtenção experimental deVmáx.
Outra forma de encontrar o valor de Vmáx é variando a concentração desubstrato, obtendo valores diferentes de Vo. Colocando esses valoresem um gráfico,
obtêm-se diversasretas, que se cruzarão em um ponto, que corresponde à Vmáx eaoKM.
É precisoperceber que KM independe daconcentração de enzimas.
É importante estudar o valor de KM, pois, através desse valor, pode-se compararenzimas de diferentes organismos, de diferentes tecidos do mesmo organismo ou do
mesmo tecido em diferentes estágios do desenvolvimento. O KM é inversamente
proporcional à afinidade da enzima pelo substrato: quanto menor KM, maior aafinidade.Atualmente, na escolha de um substrato, deve-se levar em conta não apenasKM,mas também a Vmáx. Um bom substrato apresenta KM baixa e Vmáx alta, o queresultará emum alto valor de constante deespecificidade.
A atividade molecular é o número de moléculas de substrato transformadas porminuto por moléculasde enzima. Quando a enzima está saturada com substrato, isto
é, [S] >>KM, a Vmáx=kcat [E]total. Portanto, a constante de especificidade tambémpode ser escri tacomo:
2) Efeito do pHe da temperatura
Como dito anteriormente, as reações enzimáticasocorrem por causa da ligaçãodo(s) substrato(s) a um local bem definido da enzima, o
sítio ativo, formado por
interações intermoleculares entre os grupos químicos presentes nos resíduos deaminoácidos que compõem a estrutura primária de uma proteína. Como essas
ligações são fracas, a estabilidade estrutural do sítio ativo e da molécula de enzimacomo um todo depende de condiçõesótimasde temperatura e pH. A variação do pHpode causar mudança das cargas em resíduos de aminoácidos carregados
eletricamente. Em determinado pH, regiões inadequadamente carregadas podemsofrer eventos de repulsão ou atração desastrosos para a estrutura da proteína,
afetando sua atividade. Se as cargasalteradas estiverem diretamente relacionadas àmanutenção da estrutura do sítio ativo, a eficiência da catálise será comprometida.
Por conta disso, existe um valor de pH ótimo para cada enzima, no qual o balançoentre a protonação e a desprotonação das cadeiasde aminoácidos proporciona uma
estruturaenzimáticaque apresenta plena atividadecatalítica.No caso da temperatura, toda a estrutura pode se desestabilizar, uma vez que
ligações de hidrogênio e outras interações fracas, fundamentais para a manutençãoda estrutura secundária são desfeitas facilmente em temperaturas acima de 50°Cna
maioriadoscasos.Quando ocorremalterações na conformação dasproteínas, diz-se que a proteína
está desnaturada, perdendo assim seu poder catalítico.
3) Tempo de reaçãoQuanto maior o tempo de reação, menor asua velocidade, por conta do consumo
dos reagentes.
Espectrofotometria
A espectrofotometria é um método utilizado para determinar a velocidade da
reação. Nesse método, ou o substrato ou o produto devem absorver luz em umdeterminado comprimento de onda.Para isso, é preciso saber qual o comprimento de
onda que a substância mais absorve. Sabendo isso, nota-se que, quanto maior aconcentração da substância,maior será aabsorbânciadamesma.
Inibição enzimática
 Inibição irreversívelOs inibidores irreversíveissão aqueles que se combinam a um grupo funcional na
moléculade enzima essencial à sua atividade, provocando amudança permanente desua conformação.
 Inibição reversível
o Inibidorescompetitivos
Um inibidor competitivo concorre com o substrato pelo sítio ativo da enzima e emgeral a reação não ocorre com o substrato quando o inibidor estiver ligado à enzima.
Durante o tempo em que o inibidor ocupa o sítio ativo, este impede a ligação dosubstrato, porque a estrutura tridimensional do inibidor competitivo é parecidacom ado substrato.
Como o inibidor se liga reversivelmente à enzima, a competição pode se tornarfavorável ao substrato pela simples adição de substrato ao meio de reação. Assim,
quando substrato suficiente estiver presente, será mínima a probabilidade de e ligarumamolécula de inibidor à enzima. Assim, a Vmáx obtida é mesma paraumamesma
enzimacom ou sem inibidor. No entanto, napresençade inibidor, KM será aumentado.
o Inibidoresnão-competitivos
O inibidor não-competitivo liga-se em um sítio diferente daquele que se liga aosubstrato, não bloqueado a ligação entre enzima e substrato. A enzima é inativada
quando o inibidor está ligado porque ele altera sua conformação e o substrato deixade conseguir se ligar aosítio ativo da enzima.
Neste caso, o inibidor tem a capacidade de bloquear aatividadeda enzimamesmona presença de grande concentração de substrato. Assim, há diminuição da Vmáx em
presença de inibidor.Oefeito sobre o KM é pequeno ou nenhum.
o Inibidores incompetitivos
Os inibidoresincompetitivos ligam-seemsítiosdiferentesdos sítiosdos substratos,entretanto elessó conseguem se ligar à enzima quando o complexo enzima substrato
já está formado.
Observação: Variação da energia livredeGibbs(∆G)
 ∆G< 0: reação espontânea e exergônica. Isso significa que areação é passívelde ocorrer.
 ∆G>0: reação não espontânea e endergônica. Isso significa que a reação nãoocorre. Paraque elaocorra, é necessário acoplá-la aoutraaltamente espontânea, isto
é, comumacom valor absoluto de ∆Gmaior que o da reação não espontânea.
Ribozimas
Ribozimas são RNAs com propriedades catalíticas. O RNA dos eucariotos
apresenta exons e introns. Os exons são as partes do RNA que formam proteínas, aopasso que os intronssão aspartesque não formamproteínas, masformam ribozimas.
As ribozimas são ferramentas preciosas em engenharia genética, pois clivamfragmentosprecisos de RNA, analogamente àsenzimasde restrição para o DNA. Além
disso, elas têm capacidade de inativar um RNA alvo escolhido no interior de umacélula, permitindo, por exemplo, que sejamutilizadascomo antivirais.
Hoje, com a descoberta da função catalítica do RNA, esta molécula passou a seruma for te candidata paraamolécula primordial da vida, pois reúne tanto informação
(ácidosnucléicos) quanto função (proteínas).