Relatório - Análise Microbiológica de Alimentos

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Universidade Federal do Ceará 
Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem 
Departamento de Farmácia 
Curso de Farmácia 
 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS 
Pesquisa de Bactérias Gram Negativas no Leite de Saco Tipo A 
 
 
Disciplina: SH0927 - Microbiologia Básica e Aplicada 
Professor: Hélio Vitoriano Nobre Júnior 
Aluno: João Antônio, Pedro Nonato e Vinícius Serra 
Turma: 03A 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2016 
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Sumário 
INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 3 
OBJETIVOS ................................................................................................................................. 4 
MATERIAIS ................................................................................................................................. 4 
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................................ 4 
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 7 
CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 7 
ANEXOS....................................................................................................................................... 8 
REFERÊNCIAIS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................... 9 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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INTRODUÇÃO 
 Quase todos os alimentos que consumimos, estejam eles frescos, prontos ou em 
conserva, raramente são estéreis. Em vez disso, eles quase sempre se encontram 
contaminados com diversos microrganismos associados à deterioração dos alimentos e 
ocasionalmente com patógenos. Porém as atividades microbianas são essenciais para a 
produção de alguns alimentos, como os que são produzidos por processos de fermentação, 
tendo como exemplo pães, carnes para embutidos, queijos, vários laticínios, porém a 
maioria dos microrganismos encontrados são indesejados e diminuem a qualidade ou 
segurança do produto. 
 Muitos alimentos fornecem um meio excelente para o crescimento de bactérias e 
fungos. Alimentos armazenados corretamente também podem sofrer deterioração, mas 
geralmente não constituem um veículo para a transmissão de doenças se estiverem 
inicialmente livres de patógenos. Isso se deve ao fato de que, com raras exceções, os 
organismos responsáveis pela deterioração dos alimentos não são os mesmos que 
desencadeiam as doenças alimentares. 
 O leite de animais domesticados, objeto de análise microbiológica relatado no 
presente relatório é um dos componentes da base alimentar de muitos países e serve como 
precursor de numerosos laticínios, como a manteiga, o queijo, o iogurte, entre outros. As 
categorias de leite comercializadas no Brasil abrangem os tipos A, B e C, o tipo A 
corresponde a leite retirado pela ordenha mecânica que vai direto para um tanque, onde é 
aquecido até 72-75°C e depois resfriado imediatamente em aparelhagem a placas até 
temperatura igual ou inferior a 4°C, processo conhecido como pasteurização, onde toda a 
produção é feita na própria fazenda, com o mínimo de contato humano,. O tipo B assim 
como no leite tipo A, tem ordenha mecânica porém os processos de pasteurização e 
envasamento, podem ser feitos em fora da fazenda. No tipo C a ordenha é manual ou 
mecânica, o leite pode ser armazenado em tanques não refrigerados antes de seguir para 
o laticínio onde será pasteurizado e envasado, por estar sujeito a mais contaminação seus 
parâmetros de qualidade são menos rigorosos, porém visam manter a qualidade. 
 O produto utilizado na análise microbiológica foi um leite tipo A da marca 
Maranguape acondicionado em embalagem plástica de saco, com o objetivo de constatar 
se o mesmo estava apto a consumo humano. Na literatura muitas bactérias de diferentes 
gêneros Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, 
Proteus, Salmonella podem estar presente no leite e servir como parâmetro de qualidade 
para classificar o leite como seguro para consumo humano. 
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OBJETIVOS 
Realizar a análise microbiologia da amostra de leite tipo A da marca Maranguape, 
com o intuito de constatar sua qualidade e se a mesma preenche requisitos para consumo 
humano. 
 
MATERIAIS 
 Bico de Bunsen 
 Pipetas graduadas de vidro (1 mL) 
 Tubos de ensaio 
 Solução salina 0,75% 
 Leite tipo A de saco 
 Erlenmeyer 
 Meio Àgar Plate Count 
 Meio TSI 
 Meio Hektoen 
 Meio SIM 
 Meio Àgar Citrato de Simmons 
 Alça de Platina 
 Agulha de Platina 
 Placas de Petri 
 
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 O procedimento experimental iniciou-se com o acendimento do bico Bunsen para 
que fosse criada uma área de esterilidade e o risco de contaminação das amostras fosse 
mínimo. Durante todo procedimento buscou-se trabalhar sempre atrás da chama e flambar 
alça e agulha de platina além das bocas dos tubos de ensaio antes e depois de semeá-los. 
 Utilizando uma pipeta graduada transferiu-se 1 mL do leite para um dos tubos 
contendo 9 mL de solução salina 0,75%, em seguida a partir deste tubo mais concentrado 
(10-1) foram feitas sucessivas diluições da amostra em tubos semelhantes até que se 
criassem cinco concentrações da amostra de leite (10-1 ,10-2 ,10-3, 10-4, 10-5 ,10-6). 
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 Para o plaqueamento utilizou-se apenas as soluções com concentrações 
intermediárias (10-2 à 10-5), descartando assim a solução mais concentrada (10-1) e a mais 
diluída (10-6). Em duplicata foi colocada uma alíquota de 1 mL de cada um dos tubos de 
ensaio em uma placa de petri. O meio ágar plate count é um meio nutrivo destinado à 
contagem de microrganismos, sendo utilizado principalmente no controle microbiológico 
de alimentos, à temperatura ambiente encontra-se solidificado, por isso foi necessário 
aquecê-lo em micro-ondas para que ele se tornasse liquido, após a realização desta etapa 
ele foi adicionado ainda quente a cada uma das placas, e após esta ação foi feito um 
movimento em forma de “oito” sobre a bancada com a placa para que houvesse 
homogeneização do meio na mesma. Por fim as placas devidamente identificadas foram 
levadas para a estufa onde permaneceram por 24 horas à 35 ± 2° C. 
 Após o período de incubação as colônias de cada uma das placas foi contada e foi 
feito o cálculo para determinar o grau de contaminação de cada uma das concentrações: 
Fórmula: P1 + P2/ 2= Z 
 P1:Placa 1 da concentração X 
 P2:Placa 2 da concentração X 
 O resultado obtido foi multiplicado pelo inverso do fator de diluição de cada uma 
das amostras e o grau de contaminação foi expresso em UFC/mL (unidades formadoras 
de colônia por mililitro). 
 
CONCENTRAÇÃO P1 P2 UFC/mL 
10-5 < 30 < 30 - 
10-4 < 30 < 30 - 
10-3 < 30 < 30 - 
10-2 49 150 9850 UFC/mL 
 
 Como a concentração de 10-2 ela foi escolhida para o procedimento subsequente, 
neste utilizando uma alça de platina foi semeado colônias isoladas da amostra escolhida 
em meios: MacConkey, utilizado para detecção de bactérias Gram (-) em especial 
Enterobacteriaceae e Eschereshia coli, fermentadoras ou não de lactose; e meio Hektoen, 
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utilizado para identificação de Salmonella e Shingela, além de poder detectar 
microrganismos produtores de H2S (colônias com centro negro), microrganismos gram 
(+) não crescem nestemeio devido a mistura de sais biliares e corantes presente nele. 
Após semear as placas estas foram levadas para a estufa onde permaneceram por 24 horas 
à 35 ± 2° C. 
 No dia seguinte foi observado se houve ou não crescimento nos meios de cultura, 
no meio MacConkey não houve alteração, já o Henktoen passou de sua cor verde escura 
e uniforme para uma cor mais amarronzada com várias camadas, presumiu-se então que 
houve crescimento de bactérias neste meio, este então foi utilizado para a última parte do 
procedimento experimental que consistia nas provas bioquímicas. 
 Com o auxilio de uma agulha de platina foram semeadas alíquotas da possível 
cultura que havia crescido no meio Hektoen, em meios: SIM (Sulfeto Indol Motilidade), 
utilizado para avaliar a motilidade, produção de indol (em conjunto com reagente de 
Kovacs) e sulfeto; TSI (Tríplice Sugar and Iron) é um meio sólido distribuído em uma 
base de inclinação, é constituído de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), 
peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sódio e citrato férrico 
amoniacal (indicador da produção de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, o 
vermelho de fenol; e Citrato de Simmons que consiste em um meio semi-sólido de base 
inclinada que possui azul de bromotimol como indicador, em pH entre 6,8 e 7 apresenta-
se verde, a alcalinização do meio resulta em prova positiva provocada pela produção de 
oxalacetato e acetato pela enzima citratase, que faz com que o meio se torne azul. 
 Ao fim das experimentações e traçando um paralelo entre os resultados foi possível 
avaliar se realmente havia algum tipo de contaminação na amostra e se sim, avaliar qual 
seria o microrganismo responsável por ela. 
 
 
 
 
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RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Não foi observado crescimento microbiano em nenhum dos testes bioquímicos. Isso nos 
leva a pensar que o leite analisado encontrava-se sem contaminações, porém uma série 
de fatores pode ter induzido esse resultado: 
 O meio Agar Plate count foi colocado numa temperatura muito elevada sobre a 
amostra de leite nas placas, o que poderia justificar o baixo crescimento 
microbiano. Como foi previamente dito, apenas uma das placas foi observado 
crescimento microbiano considerável (9.850 UFC/mL) 
 Outro fator associado ao baixo crescimento microbiano foi a possível 
homogeneização inadequada do meio na placa. O pouco crescimento observado 
não foi pontual, podia ser obsevado na placa na forma de manchas ; 
 Formação de grumos na primeira placa (10-5), isso se devido pois o meio já 
estava resfriando. 
 Acreditou-se que a mudança no meio Hektoen entérico de verde para marrom 
fosse em decorrência do crescimento bacteriano. Mas como não foi observado 
crescimento de colônias nas provas bioquímicas, concluiu-se que a alteração na 
coloração do meio se deu pelo tempo que a placa passou na estufa (mais de 48h) 
e não pela proliferação de algum microrganismo 
 
 
CONCLUSÃO 
 A amostra de leite apresentou uma carga bacteriana correspondente a 9.850 
UFC/mL que está dentro do que preconiza a Instrução Normartiva nº 62 do Ministério da 
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (100.000 UFC/mL). Porém este resultado não é 
confiável haja vista, os erros enfrentados durante o procedimento experimental da análise. 
Seria recomendável refazer os testes para confirmar se este resultado é fidedigno. 
 
 
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ANEXOS 
 
Figura 1- Placa contendo o meio Àgar Plate Count com grumos 
 
 
Figura 2 – Meio Hektoen antes (à esquerda) e depois (à direita) da semeadura 
 
 
 
 
 
 
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REFERÊNCIAIS BIBLIOGRÁFICAS 
Disponível em: http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/file/CRC/SENAR%20-
%20Produ%C3%A7%C3%A3o%20de%20leite%20conforme%20IN%2062.pdf 
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.– ANVISA. Detecção e Identificação 
de Bactérias de Importância Médica, Brasília, 2004. 
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.– ANVISA. Descrição dos Meios de 
Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos, Brasília, 2004. 
Michael T. Madigan; John M. Martinko; Kelly S. Bender; Microbiologia de Brock, 14 
edição, artmed, 2016, cap.31, pág 909-911.