AULA PRÁTICA determinação da concentração de proteínas

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AULA PRÁTICA: “DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS”
OBJETIVOS
Conhecer o método espectrofotométrico na determinação da concentração de diferentes compostos.
FUNDAMENTO
1- Espectrofotometria
A espectrofotometria é uma técnica analítica que utiliza o espectro eletromagnético para determinar a concentração de espécies químicas. O espectro eletromagnético é um conjunto de ondas eletromagnéticas. Uma onda eletromagnéticas é composta por um campo elétrico e outro magnético, que se propagam perpendicularmente e com a mesma direção. Toda onda eletromagnética pode ser caracterizada por seu comprimento de onda e por sua frequência.
Na técnica de espectrofotometria, um feixe de luz atravessa uma solução ou material biológico contendo moléculas capazes de absorver luz. Assim, parte da luz incidente será absorvida, enquanto o restante atravessará a solução e será detectada pelo aparelho. Estimando-se a quantidade de luz absorvida, é possível determinar a concentração do composto em solução. Inúmeras moléculas biológicas têm a propriedade de absorver luz, como: citocromos, clorofila, proteínas, DNA etc., o que permite sua quantificação por esta técnica.
Normalmente , a absorção de luz por um composto ocorre em vários comprimentos de onda. Se for feita uma varredura, ou seja, a determinação da quantidade de luz absorvida em diversos comprimentos de onda para um determinado composto, observamos que há um comprimento de onda na qual a absorção é máxima. A faixa mais utilizada do espectro vai de 200 nm (ultravioleta) a 1.000 nm (infravermelho). O espectro visível, aquele que é percebido pelo olho humano (cores), vai de 380 a 750 nm.
Compostos que absorvem na faixa do visível são naturalmente coloridos, mas mesmo aqueles que não absorvem luz no visível podem ser indiretamente detectados por reações químicas específicas que gerem produtos coloridos. A espectrofotometria, também denominada fotometria ou colorimetria, é indicada para determinar a concentração de solutos corados, como também os incolores, mas passíveis de adquirir cor mediante o emprego ajustado de certos reativos. Compostos desconhecidos podem ser identificados por seu espectros característicos no ultravioleta, visível ou infravermelho. As concentrações de soluções podem ser determinadas medindo-se a absorção em um comprimento de onda. Reações enzimáticas podem ser frequentemente seguidas medindo-se espectrofotometricamente o aparecimento de um produto ou desaparecimento de substrato.
O aparelho utilizado nesta técnica é denominado espectrofotômetro ou fotocolorímetro e seus componentes principais são:
1- Fonte luminosa (energia radiante)
2- Dispositivo de focalização (colimador) = transmite um intenso feixe retilíneo de luz
3- Monocromador (prisma ou grade)= utilizado na resolução da radiação emitida pela fonte luminosa em seus vários comprimentos de onda () 
4- Dispositivo para selecionar o comprimento de onda desejado
5- Um compartimento para a amostra contida em um tubo de ensaio ou cubeta
6- Um detector com célula fotoelétrica, que converte o sinal luminoso em sinal elétrico
7- Um medidor elétrico (galvanômetro) para registrar a intensidade de energia captada pelo detector.
1- Lei de Lambert-Beer
A espectrofotometria é uma técnica quantitativa, que permite relacionar a quantidade de luz absorvida com a concentração da amostra. A medida da absorção de luz é dada pela ABSORBÂNCIA (A), que é definida como:
A = log Io /I
Onde:
Io= intensidade de luz incidente
I= intensidade de luz emergente (transmitida)
Esta medida de absorbância em uma amostra está quantitativamente relacionada à sua concentração de acordo com a lei de Lambert-Beer, uma combinação das lei de Lambert “quando um feixe de luz passa através de um meio absorvente, porções iguais deste meio irão absorver luz” e da lei de Beer “a absorção da luz é proporcional à concentração do soluto na solução.	 
A absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração. 
Na prática mede-se o valor de log Io que é determinado absorbância (A): A = log Io 
				 I I
A relação inversa I/Io também é mensurável e é denominada transmitância (T). Então, pode-se afirmar que a Absorbância equivale ao logaritmo inverso da transmitância.	
A = - log T
A Absorbância e a Transmitância são lidas em escala duplas no espectrofotômetro. A absorbância é lida em escala logarítmica enquanto que a transmitância é lida em porcentagem em uma escala linear de zero a 100%.
É necessário descontar todas as interferências possíveis durante a medida da absorbância de um soluto específico. Para isso, faz-se a calibração do espectrofotômetro com uma solução contendo um sistema como o estudado, exceto o composto de análise, em um tubo ou cubeta igual àquele que irá conter a solução-problema. Este tubo é conhecido como “branco” e com ele calibra-se o instrumento para 100% de transmitância, o que significa zero de absorbância.
2- Curva-Padrão ou de calibração
A determinação da concentração de um soluto em uma solução problema pelo método espectrofotométrico envolve a comparação da absorbância da solução-problema com uma solução de referência, da qual já se conhece a concentração do soluto. Em geral, são utilizadas soluções-padrão do composto que se deseja quantificar, com diferentes concentrações, e sua absorbância é determinada. Com os valores de absorbância e concentração conhecidos, pode-se traçar um gráfico cujo perfil é conhecido como “curva de calibração” ou “curva-padrão”. A reta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indica a proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância.
Aplicando-se a lei de Lambert-Beer, ao se plotar o valor da absorbância da amostra-problema no gráfico da curva de calibração pode-se, por projeção, determinar a concentração do soluto.
Tubo branco= irá conter todos os reagentes do ensaio, menos a amostra. É utilizado para “zerar” o aparelho, descontando a cor dos reagentes utilizados no ensaio.
Solução-padrão= irá conter a mesma classe de substância presente na amostra, porém de concentração conhecida e que será utilizada para confecção da curva de calibração.
Amostra= irá conter uma solução de substância conhecida cuja concentração pretende-se determinar.
TÉCNICA
I - CURVA DE CALIBRAÇÃO
Constrói-se uma curva de calibração utilizando a solução-padrão de proteína de acordo com o protocolo mostrado abaixo, fazendo-se as leituras em 540 nm.
	Tubo
	Volume da solução padrão de proteína (5mg/mL)
	Volume de água (mL)
	Volume do reagente de biureto (mL)
	Absorvância 540 nm
	1
Branco
	0,0
	1,0
	5,0
	
	2
	0,2
	0,8
	5,0
	
	3
	0,4
	0,6
	5,0
	
	4
	0,6
	0,4
	5,0
	
	5
	0,8
	0,2
	5,0
	
	6
	1,0
	0,0
	5,0
	
1- Organizar 6 tubos de ensaio e identificá-los com números de 1 a 6.
2- Adicionar os reagentes conforme tabela acima.
3- Agitar e deixar em repouso por 10 minutos.
3- Utilizar o tubo 1(Branco) para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância em 540 nm.
4- Determinar a absorbância das soluções dos tubos 2 a 6.
5- Traçar, em papel milimetrado, o gráfico: concentração final de proteína (mg/ml) na abscissa e absorbância (A) na ordenada. Interpolar a melhor reta possível, passando pela origem dos eixos cartesianos.
 Absorbância
 (540 nm)
Concentração
 (mg/tubo)
II- DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM AMOSTRA-PROBLEMA
1- Separar 2 tubos de ensaio.
2- Identificá-los como tubo A e tubo B.
3- Adicionar os reagentes conforme tabela abaixo.
3- Agitar e deixar em repouso por 10 minutos.4- Determinar a absorbância das soluções desconhecidas (tubo A e tubo B), utilizando o tubo 1 (item I) para calibrar o espectrofotômetro (Absorbância em 540 nm);
5- Determinar a concentração de proteína (mg/mL) presente na amostra problema utilizando o gráfico da curva de calibração (item I) e realizando os cálculos necessários.
	Tubo
	Amostra (mL)
	Volume de água (mL)
	Volume do reagente de biureto (mL)
	Absorvância 540 nm
	A
	1,0
	0,0
	5,0
	
	B
	0,5
	0,5
	5,0