Aula 09 - Purificação de Proteínas

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Purificação de proteínas
Dr. Emmanuel V. Pontual 
(Bolsista PNPD – FACEPE/CAPES) 
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Fisiologia – UFPE
E-mail: emmanuelpontual@yahoo.com.br
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Conjunto de processos visando o isolamento de uma proteína a partir de uma mistura complexa.
POR QUE PURIFICAR?
Purificação de proteínas
Proteína de interesse
Proteína de interesse
Inibidor
Contaminantes protéicos
3
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
OBJETIVOS
 Quantidade e pureza suficientes
 Manuntenção da atividade biológica
 Rapidez e simplicidade
 Economia
SELEÇÃO DO MATERIAL DE PARTIDA (FONTE)
Purificação de proteínas
 Disponibilidade
 Concentração de proteínas
 Uso popular
5
ESCALA ANALÍTICA
 Visa a separação e quantificação de proteínas através do maior número de medidas precisas em um curto período de tempo.
 Prioriza o rendimento.
 Ao final, o material é usualmente descartado.
Purificação de proteínas
ESCALA PREPARATIVA
 Visa a obtenção de proteínas isoladas para posterior aplicação biotecnológica. 
 Usualmente envolve grandes volumes de material de partida
 Geralmente necessita de considerável período de tempo (dias, semanas, meses)
 Requer uma variedade de diferentes métodos de purificação ou técnicas (algumas vezes repetidas)
 Tem como objetivo principal alcançar elevado grau de pureza em detrimento de um elevado rendimento.
Purificação de proteínas
Etapas iniciais no desenvolvimento de estratégias para purificação de uma proteína
Purificação de proteínas
1
Escolher ou desenvolverum ensaio SENSÍVEL, REPRODUTÍVEL E SELETIVO para acompanhamento da proteína de interesse.
2
Estabelecercondições nas quais a proteína de interesse seja estável e biologicamente ativa.
3
Encontrar condições nasquais a proteína de interesse possa ser estocada seguramente entre as etapas de purificação.
4
Escolher omelhor material de partida (fonte natural ou recombinante).
5
Desenvolver ouescolher métodos apropriados para extração em larga escala.
6
Diminuir viscosidadede extratos brutos e remover partículas.
7
Reduzir volume.
8
Tecido a fresco
Obtenção de homogenatos e extratos protéicos
Homogeneização
Purificação de proteínas
9
Lisados celulares
Purificação de proteínas
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SOLUÇÕES PARA EXTRAÇÃO: 
- ÁGUA DESTILADA
- SOLUÇÃO SALINA (ex. NaCl 0,15 M)
- TAMPÕES (pH constante)
Purificação de proteínas
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Solubilidade de Proteínas
Regiões Hidrofóbicas (Apolares)
Regiões Hidrofílicas
(Polares)
Determinam a solubilidade
Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e lipídeos conferem diferentes solubilidades às proteínas.
Purificação de proteínas
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Solubilização (extração)
1) pH
pH = pI (precipitação)
Purificação de proteínas
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2) TEMPERATURA
 Preservação de atividade e estrutura
 Extração em nitrogênio líquido (-196 ºC)
 Como estratégia de exclusão (purificação parcial)
3) TEMPO DE EXTRAÇÃO
Purificação de proteínas
Solubilização (extração)
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PROTEÍNAS DE MEMBRANA
Purificação de proteínas
Solubilização (extração)
MIC
MEC
Membrana plasmática
CHAPS
Surfactante Não-Iônico
Detergentes Não Desnaturantes
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 Precipitação térmica
 pH (precipitação isoelétrica)
 Solventes orgânicos:
 acetona, etanol, metanol
Concentração da Proteína de Interesse
Purificação de proteínas
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Sulfato de amônio 
Salting-out
PRESERVA A ESTRUTURA NATIVA DA PROTEÍNA
Purificação de proteínas
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Diálise
Purificação de proteínas
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Método físico-químico de separação
Migração diferencial dos componentes de uma mistura
Diferentes interações entre duas fases imiscíveis
Fase móvel
Fase estacionária
Técnica versátil e com grande aplicação.
Purificação de proteínas
CROMATOGRAFIA
Separação das proteínas de acordo com:
 Tamanho (exclusão molecular)
 Afinidade
 Carga líquida (troca iônica)
CROMATOGRAFIA
Purificação de proteínas
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Cromatografia de exclusão molecular
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia de afinidade
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EFICIÊNCIA E SELETIVIDADE
Alta seletividade
Baixa seletividade
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Purificação/Isolamento de proteínas
↑ ATIVIDADE ESPECÍFICA (AE)
AE = Atividade (A) 
Proteína (P) 
A: 32-1
P: 12
A: 32-1
P: 9
A: 32-1
P: 5
AE: 2,7
AE: 3,5
AE: 6,4
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Eletroforese
26
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Eletroforese
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Eletroforese
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Eletroforese em condições desnaturantes
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Eletroforese em condições redutoras
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Eletroforese
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