contagem bacterias lacticas

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Capítulo 14 
Contagem de Bactérias Lácticas 
14.1. INTRODUÇÃO 
Bactérias I<hicas são um grupo que tem como prin cipal caraCLcrís ti ca a fermentação de 
carboiclratos com produção de ác ido láctico. Originalmente, esse grupo incluia quatro gêneros de 
grande impon:\I1c ia em alimentos: Laclovacillus. Lellcol1osfOc, Pediococc/l.s e Sl'rejJlocorcns. 
Gradativamcnlc, esses gêneros foram subdivididos nos novos gêneros CanwúacleriulII, Enterococc1L'I, 
LacloCOCC/ls, Oenoroccus, iNragcllororrus, Vt-Igococcusc jtI,'eissclla (Euzéby, 2006a, Dsmz, 2006, Hall el aI., 
2001 ), nuas principais ca racterísticas encon lram-se su mariadas no Quadro 14.]. 
Todas são Gnltl1 positivas, não esporogênicas, anacróbias facuhativas, cata lase e oxidase ne-
gativas. O metabolismo de carboidratos pode ser homoferrnelllativo, resultando primordialmellle 
em ácido láctico, ou hClcrofenn elllat.ivo, res llltando em <Ícido !;:ÍCtico, CC:! e outros produtos de 
fernlcnt.."lção. Ao; exigências nutricionais são complexas, a maioria depe ndendo da presença de vila-
minas, ca rboidralos e o ulros falo l"es para o crescimclllo. Ace tato e tween 80 são estimuladores do 
crescimento para a maiol"ia , sendo normalmeme adicionados aos me ios de isolamento. 
LeuCOIlOstOC van Tieghem 1878 
Informações dc Euzéby (2006b), Bjõrkrolh & I-Io lzapfe l (2003) e Holl. el ai. ( 1994 ) . 
É um dos gêneros originais de bacté rias lácticas c algumas espécies de importância em ali-
mentos fo ram reclassificadas nos novos gêneros Oenococclls e Weisse/la. Nos alimentos podem ser 
encontrados C0 l110 dele riorames ou como coadjuvames de rabricaç~lo de produtos fermentados. L. 
mesenteroides subsp. cremoris é freql"lelll.emente incorporado em produtos hícteos, para acentuar o 
"flavor" at.ravés da produção de diacelil. L. mespnleroideçsubsp. mesenleroides, embora não seja a espécie 
dominante, exerce um papel importante no início da fermentação de chucrule e pepinos fermenta-
dos. Em sucos de fi"tnas, ao comr;,\rio, os leuconoslocs são deteriorantes, provocando alteração do 
sabOl~ devido à produção de aceloína e diace lil. Também participam da deterioração de carnes 
embaladas à v::ícuo ou em atmosferas modificadas, provocando limosidade superficial e aroma de 
fennent..'1do. L. camo:wm e L. ge/idulltsão deteriorantes de presunto faliado embalado à vácuo, onde 
provocam pontos de coloração amarela. Na produção de açúcar, L. mesenleroides subsp. lIIl!senleroides 
provoca perda de rendimento, consumindo até 5% da sacarose da cana por dia , enl.re a colheita c o 
processamcnto. Também produz a goma dextrana , que interfere nas elapas de refino. 
A morfologia é de cocos, imóveis, frcqücllI.cmemc lenticulares, ocorrendo em pares ou 
pequenas cadeias. Requerem am ino;:íc idos, peptíclcos, ác idos graxos, ;:ícidos nucleicos, vitaminas 
e carboidratos fermentáve is para o crescimento. São hClerofermcntativos e crescem melhor em 
meios neutros ou levemen te ácidos, sendo menos acidúricos do que os lacLObacilos. A temperatu-
205 
ra ó tima c de 20 a 30"e, com míni mo po r vo lla de 5"e , cxcelO os da ( arn c ( L. carnosu ln e L. 
gelidllm) , que são psicrotróficos, podem crescer a I"e e nào crescem a 37!!e. A maio ria das cepas é 
ae rololcra nle mas cresce melhor cm condições microacró fi las. 
Quadro 14. 1. Pri ncia is c;lr<lctcrfsticas da bactérias Irtc ticas ;1 ~M)Ci:tdas com ali mcntos (ElJ l.éby. 2006b. HolI If l aI .. 199~). 
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Pediacaccus Balcke 1884 
Informações de Euzéby (2006b), Holzapfcl et a!. (2005) e Holt el ai. ( 1994). 
É um dos gêneros originais de bactérias lácticas c algumas espécies de importância em alimen· 
tOS foram reclassi ricadas no novo gênero Tétrogenococcus. Nos alimen tos podem ser enconuà dos como 
dctcliorantes ou como coadjuvantes de fabl;cação de produtos fe rmentados. P. aâdiloclic~ P lNmlosaceus, 
p. pal'lJuLu.·;, I~ inopinalus e P dexlriniclIssào associados à fermentação de chucrule, pepinos, aze itonas, 
cnsilagens de fon agem e O llU'OS p rodutos de origem vcgel..:'l1. Em vários países da Ásia sâo adicionados 
asubstratos I;cosem amido, para a produção de bcbidas alcoólicas. Em pr<xllllos c.:-lmcos como linguiças 
curadas, P. acidilacliri e P. j)(mlosacl'/ls l..:'lmbém parecem panicipar do processo de fennel1l.açáo e 
maturação. I~ dall/l1oslIsé associado <I dete l;olàç.lo de cervejas e \~ n hos. 
Os pecliococos sâo cocos Gra m positivos imóveis, que se dividem em dois planos e em ângulos 
retos, rormando tét.rades (agrupamento de qua tro células) . As células nunca são alongadas, nunca 
fonuam cadeias e também podem ocorrer em pares, especialmente en u'e o início e o meio da fase 
logaIíunica de crescimento. Células isoladassáo mais raras, mas podem aCOITeI'. 5.:""10 homorcrmentativos 
ccatalasc negativos, mas algumas cepas apresentam .Hj\~ dade de pseudocalalase, em meios contendo 
baixa concentração de carbo idratos. A tempera tu là ó LÍ ma de crescimento varia enlre 25 e 40!!C, algtl· 
mas espécies podem crescer a 45!.lC mas não crcscem a I OUC, com ra ras exceções. 
StreptococClIS Rosenbach 1884 
Info rmações de Euzéb)' (2006b), Ho IL e/al. ( 1994) eSnealh ('I ai. ( 1986). 
É um dos gêne ros originais de bacté ri as híclicas, mas a maioria das espécies de im portância 
cm alimentos foram reclass iricadas nos novos gêne ros Enlerococcus c Lactococcus. Uma espécie, S. 
IhermoPhilus, é a mplamente uLi li zada como fc nnento hktico na produção de iogunes, leites fe l'· 
mClltados e quc Uos. S. 'lIbelise S. dysgalacliae p rovocam mastite cm gado leitei ro, con l..:'lm inando o 
Icite cru (L'lfarge el a!. , 2004). S. bovis e S. eqllinlls são habitantes normais do llàto intestinal de 
bovinos e equinos, res pec ti vamente. sendo considerados "es lreptOCOcos feca is" e ap resentando 
várias caraClerísticas e m comum com os Enllrrocorcus (vide Capítu lo 13) . 
Os eS lreptococos são esféricos ou ovóides, imóveis, gera lme nte arranjados aos pares 0 1.1 
cadeias. Anaeró bios bculta ti vos , algumas espécies exigem CO~ para crescime nto e algumas são 
anaeróbias eS lritas. O meta bo lismo de carboid rmos é homofcrme ntativo, com reque ri mentos 
nlltl;cionais com plexos e va ri .. \ve is. A le mpelàlura ótima de crescimento é 37u C e a máxima c a 
mínima valiam entre as espécies. S. IhennojJlúlusé anae róbio facultativo, termodúl-ico e resiste à pasteu· 
ri7~1Ção clássica (60"C/ 30min ). Cresce rapidamente em le it.e a 45"C, com tcmperal.Ur::l mínima en trc 
19-2 1°C c má.x ima de 52"C. Não cresce em 40% de bi le, em4 % de NaCI ou em pI-l 9,6. 
Ladobacilllls Beijerinck 1901 
Infonn ações de Ha mmes & Henel (2003), I-Iolt et aI. ( 1 99~1 ) e Sneath el aI. ( 1986). 
É um dos gêne ros originais de bactéri as hícLi cas e v.í ri as espécies de importância em ali· 
IllCnlOS foram reclass iricadas nos novos gêne ros Carnobacteriwn e Weissella. São bacté rias ex tre ma-
mcntc Íl teis, mu itas delas reconh ecidas como probióticas, inclui ndo L acidolJhil'lts, L. rhamnoslts 
c L casei. Nos ali mentos, podem ser Uli li zadas como coacljuvallles de fabricação de inúmeros 
produtos fe rmentados: L. de/bruee/rii subsp. blllgmicusé lILili zado como fe rmento hícLico na produ· 
ção de iogurtes e leites fe nnell tados. L. helueticlls, L. delbruec/úi subsp. lactis e L. delbruec/rii subsp. 
bulgariCIlS, em combinação com SI,rejJlococCIls IltenflojJltilus. são utili zados como re rme nto na produ· 
çãode que ijos. L.brevis, L. p/onta1'll1ll, L curvalus e L. saheisão associados à fe rmelltação de chucnl te 
207 
) 1<lll11al (k /l1~~"do,.k ' \l1 .ilisc ~licrohiológiGI d e /\limel1lo'l c Âgu;, 
e pepinos. L. P/lIl1tllnlm, L. sahei, L. rUI1Jl1tlls, e m associação com Staph)'{ococcus e 1\11icrocOCCllS, são 
utilizados como fermento na fabricação de produtos cám eos fermentados. Em contraste, tam-
bém são deteriorantes de produtos ;:íc idos, inclu indo L. fruclivorans e L. brevis e m maio nese e 
o uu-os molhos para sa ladas, L. fnlctivoralls e L./J/auiam", em p rodutos vege tais e várias espécies 
em sucos de frutas, re fri gerantes e o utros a lim entos. 
A morfo logia é de bastonetes, imóve is (com raras exccções), usualme nte regula res e de 
tamanho variado. A1gumas espécies fo rmam pequenos cocobaci los, que le mbram Leltconosloc. 
Algumas espécies aprcse1llam vat-iação na mo r fologia, como é o caso de L. dellmleckii subsp. 
bulgaricus, que pode formar baston etes regu la res o u lo ngas espirais. A fo rma de espirais também 
é encontrada cm L. cU/1m/lIs, cujas cé lulas são curvas_ 
Algumas espécies apresenta m aLividade de cal.a lase o u pscudocamlase em me ios contendo 
sangue_ Podem ser homofcrmc nLa ti vos, produzindo mais de 85% d e <íc ido I;icl.i co a panir da 
glicose, o u he te ro l"e rme ntaLivos, produzindo ~ici do hictico. CO." etanol c / o u ~íc ido acético. Re-
q uerem aminoácidos, peptídeos, ácidos graxos, derivativos de ácidos nucle icos, vita minas, sais e 
carboid ratos I"e n nentáveis para o crescime n to . A maioria cresce melhor em condições anaeróbias 
o u microaerófilas. A temperatura ót.ima d e crescimento é de 30-40llC e o c resc ime nto a J 5 o u 45uC 
varia en tre as espécies. São acid üricos, crescendo e m pH 4,5 e não em pH 9,0. 
Ellterococcus (ex Thiercelin & Jouhaud 1903) Schleifer & Kilpper-Bãlz 1984 
Informações de Euzéb)' (2006b), Devriese elal. (2000) e Ho ll el aI. (1994). 
Esse gênero roi criado em 1984 para acomodar os anteriormente chamad os "estreptococos 
feca is" do grupo soro lógico O de Lancefie ld, que têm o trato intes tinal como habita t na tural c 
ocorrem em grande quantidade nas fezes humanas e de outros animais. São microrganismos 
indicadores, util izados para ava liar a efici ência d e d esinfecção de p lantas de p rocessamento ou a 
qua lidade h igiênico-sani téiria d e produtos ác idos o u congelados. Nos a limentos po d em ser 
deterio rantes de em butidos c<Írneos cozidos ou tratados te rmicamenl.e, mas, e m contraste, sua 
presença é des~j éive l C111 uma va ri edade d e queijos maturados, para conferir aroma e OUlros au;-
butos sensoriais (produção d e aceta lde ído, aceto ína e d iacetil ). Algumas cepas d e E.faecalis, E. 
faeciull/.o u E. duranssão adicionados como fe rme nto láctico na produção de queijos, para melhor 
padronização das caraClerísticas sensoriais do p rodu to final. Algumas cepas de I:;. faecium são 
probió ticas, prevenindo ou red uzindo o tempo de duração de diarréias e m an imais e humanos. 
An ae róbios facu ltativos, fe r11l e nléUll carboidra tos p roduzindo p red o minanl.emente ácido 
láClico, sem produção de CO~ (me tabolismo homofennentati\'o). A morfologia é de cocos, que 
OCOlTcm predominante mcnte aos pares ou pequenas cadeias. A1gumas espécies são pigme ntadas 
(E. mU1/dlii, E. casselijlavlIs) ou móveis (E. casselijlOTJlL'i, L gaLlinarum.). São mesófil os e a temperaLU' 
ra ótima d e crescimen to é de 37<JC, mas a maioria consegue crescer a 10 e a 45l!C. Hidro lisam a 
esculina, produzem as e nzimas pirogll1lamato élm inopeptidase (PYR) e leucina aminopeplidase 
(lA P ) , c rescem na presença de 40% de bi1c, em 6,5% d e NaCI e em pI-l9,6. E. faecaüse E.faeciuln 
sào relativamente resistenl.es aos tratame ntos lé rmicos e podem sobreviver à pasteuri zação do 
le ite. A maioria também é relativamente resistente aO congelamen to. 
Lac/ococcus Schleifer et a/. 1986 
In fo n nações de Euzéb)' (2006b), Teubcr& Geis (2002) e 1-10 11 e/ aI. (1994 ). 
Esse gênero I"o i c riado e m 1986, para acornodar espécies anl.e rio rmente classificadas como 
S/replococCl/s (S./ac/is, S. rafjinolaclis, S. cremoris, S. garvieae, S. plan/tl/'um.) e Laclobaóllus (L. hon/lliaee 
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C"III;Jg"m de I\aCIl'rias l..;icliGl~ 
L ).)'los'1/.s). São isolados predominanteme nte de leite e produtos lác teos, onde ocorrem natural-
mente. L. laclissubsp. c1"Cmorise L./ar./issubsp./ac/issão u tili zados como fermenLO na produção de 
vários produ LOS lácteos fe nncntados. 
Os lacLOcocos formam células esféricas ou ovais, arranjadas cm pares ou pequenas cadeias, 
imóve is. São microaerófilos, homofcnncntativos, a temperatura ótimil é de 30!lC, crescem a 10!lC 
e algumas espécies também a 45ue. A maioria pe nence ao grupo sorológico N de Lanccficld, 
principal caractel"Ística que os diferencia dos estrep tococos. 
Camobacterium Collins et ai. 1987 
Informações de I-I ammcs & I-Ienel (2003), Euzéb)' (2003) e I-Ioll el ai. ( 199~1 ). 
Esse gênero foi criado cm 1987, para acomodar espécies anteriormente classificadas como 
Lac/obacill-us (L. camis, L. divmgense l.. piscicola). São deteriorantes de a limentos, isolados predo-
minantemente de emblllidos C<Írneos e mbalados à vácuo, podendo também ocorrer em peixcs, 
leite e queijos. C. mallaroma/icul1/. provoca odor de malte em leite e C. viridans é responsável pelo 
es\'ercleamento de salsichas e linguiças cmbaladas c1 ",\cuo. Algumas cepas de C. mallaromalicum. 
(anteriormente classificadas como C. /JisGÍrola) são paLOgênicas para peixes. 
Carn,obacteriull/. forma bastonet.es finos, retos ou lige iramel1lc arqueados, isolados, aos pa-
res ou pequenas cadeias. 1-lc l.e rofe nne ntativos atípicos, produzem peque nas quantidades de CO:! 
eapresentam requerime ntos nutricionais relativamente com pl exos. São mu ito semelhantes aos 
LaclQvacillus, mas, ao comn:írio desses, não crescem no Agar Rogosa SL (que contem 2,5% de 
acetato de sódio). Também não são acidúricos (não crescem e m pl-l 4,5 ou menor) e são favore-
cidos em pl-l nelllro ou alca lino (6,8 a 9,0) . Nào crescem em 8% de NaCl ou a 45°C mas crescem 
a 10°C e, eventualme nte, a O°e. Algumas espécies são móveis (C. alie/fundi/um, C. fwulilum , C. 
inhibells e C. mobile). C. /1l,dlaromaticulfI. tem temperatura óuma de 30!)C, (mínima de 6 e máxima 
de 401lC) , pl-l ótimo entre 6,0 e 7,0 e cresce no ÁgarTripticase de Soja (TSA) , fo rmando colônias 
menores do que 2mm após 48 h OI", IS de incubaçào à 25°e. 
Vagococcus Collins et ai. 1990 
Informações de ElIzéby (2006b), ElIzéby (2004,, ) e Holl el ai. ( 1994). 
Esse gênero foi criado para acomodar, inicialmente, uma nova espécie ele bactéria, com 
todas as carac terísticas de Lorloroccl.ls, porém, móvel com flagelos pe ritríquios ( V. fluvialis). Outras 
quatro novas espécies, também muitO semelhantes aos lactococos, foram descobertas posterior-
mente, mas, ao cOIll)";:Írio dos lac tococos, raramente assoc iadas com alimen LOs. Os vagococos têm 
sido isolados de diversos cspécimes clínicos, de animais c humanos. V. col'lú/Jlúl'lls foi isolado de 
carne bovi na. A palOgenicidadc dessas bactérias, sua participação no desenvolvim ento de doen-
çasou sua importância e m alimcntos ainda silo desconhecidas. 
As carac tedslicas Icnotípicas do gênero Vagococcus também são pouco conhecidas, porque a 
descrição das espécies não contempla as mesmas características, as técnicas utili zadas não S~lO idên-
ticas c o nÍlmero de cepas estudadas é muito pequeno. De mane ira geral, os vagococos são esfé ricos, 
O\âisou üTegulares, isolados, em pares ou pequenas cadeias. HomofemlentaUvos, com te mpera tu-
raóuma na faixa de 25 a 35!!C, gera lmente crescem a lO!)C mas não a 45í!C. com ra ras exceções. 
Tetragellococcus Collins et ai. 1993 
Informações de Euzéby (2006b) c Holzapfel el a/. (2005). 
Esse gênero foi criado em 1993 para acomodar lima espécie halofílica anteriOI-mente classi-ficadas como Pediocorrlls (P Iwlo/lhillls). Novas espécies foram poste riorme nte descobertas ( T 
209 
/l lall\lal dc /l lêlOdo5 de An:ilisc /I I icrohiolôgira dc Alil11clu,)S c; :\){lla 
umriaticlls, T Jwreensis) e, e m 2005, uma espécie anteriormente classificada como Enlemcocc1LS (E. 
solilarizLç) foi também alocada no gênero. Os telragenococos são caracterizados pela to lerância ao 
sal, crescendo cm concentrações maio res do que 10% de NaCI (T haloPhilus cresce em mais de 
18%) . Estão e nvolvidos na malu raçâo de presunto curado c na fermentação hictica de a li mentos 
como molhos de sqja ferme ntado, "shousurll" (molho de pe ixe fermentado ), "kimch i" (vegetais 
ferme n tados) c o utros ferme ntados com alto teo r de sa l. 
A" caraClerísticas morfológicas e bioquímicas dos l.eLragenococos sào as mesmas dos 
pediococos, d os quais são diferenciados principalmen te pela natureza halorílica. Os te tragenococos 
também são me nos to le rantes à ac idez do que os pediococos, crescendo em valores mais a ltos de 
pH (até 9,0) mas não em p H 5,0 o u menor. 
Weissella Collins et ai. 1994 
Informações de ElI zéby (2006b), Euzéby (2004b) e Bjõrkroth & Holzapfcl (2003) . 
Esse gênero foi criado e m 1994, para acomodar espécies ante riormente classificadas como 
Leuconostoc (L. paramesenleroides) e LactobaciLLus (L. conJusus, L. Jw{ololerans, L. lutndleri, L. minore 
L. viridescens). Nos alimentos podem ser encontradas como deterio rantes Oll como coacljuvantcs 
de fabricação de produtos fermentados. \V cibaria está presente e m pratos trad icio nais como o 
"tapa i" da Malás ia (preparação culinári a ferm entada e açucarada à base de mandioca ou de ar-
roz) e o "kimch i"coreano (que també m contém W Jwreensis). W confusa é isolada de ensilagens de 
forragem. W. tJammesenleroides é abundante nos vegetais frescos e parece desempenhar um papel 
impo r tante nas prime iras fases da fe rm e n tação de e nsilage ns. W. Jwlololerans, W heilenicae 
W. vilidescens são isoladas freq üen te me nte de carnes secas, ca rnes defumadas e salsichões secos. 
W vhidescens pode p rovocar esverdeamen to em produtos cárneos. W minor tem sido isolada de 
equ ipamentos utili zados na indllstri a láctea. 
As weissellas fo rmam bastonetes ( unos, cocobaci los ou cocos ovais, iso lados, e m pares ou 
pequenas cadeias, imóveis. Catalase nega tivas, W paramesenleroides pode produzir pseudocatalase 
e m me ios com baixa concentração de glicose. São anaeróbias fac ul tativas ou microae ró fil as, 
heteroFennen ú"l tivas, crescem a J 5ºC e podem crescer o u não I ° ou a 45ºC. Req uerem aminoácidos, 
peptídeos, ác idos graxos, ácidos nucleicos, vitaminas e carboidraLOs fermentáve is para o cresci-
mento. Crescem mui to pobremente no Caldo Triplicase de Soja (T S13) , mas o cresc imento é bom 
em Caldo MRS (de Man, Rogosa &Sharpe), o nde a produção de güs pode ser observada em tubo 
de Durham , após 48 a 72 horas de incubação. 
OellOCOCCUs Dicks et ai. 1995 
Informações de Bjõrkro1.h & Holzap l"el (2003). 
Esse gênero Fo i c riado em 1995 para acomodar uma espécie anteriorme nte class ificada 
como Leuconostoc (L. oenos). A única espécie do gênero, o. oeni (o nomc específico foi corrigido) 
ocorre naturalmente em polpas de fru tas e habitats relacionados. É utili zada na fabri cação de 
alguns tipos de vin hos, para converter <ic ido Imi lico em ácido lác ti co (ferme n tação malohictica). 
Essa ferme ntação secundária cont ri bui para O desenvolvi me nto do a roma, l.extura e "navor" dos 
vin hos o nde é empregada. Em OUlros tipos de vinhos pode ser detri mental, confe rindo sabor 
eSlJ'anho e c ri anelo condições favoráveis à de terioração por outros tipos de bac térias. 
Oenococcus apresenta todas as caracterís ti cas lípicas cios le uconostocs, mas, ao contrário 
desses, cresce melhor e m meios de cul tu ra ácidos (pH inicial entre 4,2 e 4,8) , pode cresce r em pH 
meno r do quc 3,9 e depende da presen ça d e suco de tomate para o crescimen to. Os le uconos tocs 
2 10 
Conlagem de ]\;,cl':ria, L:iclicas 
não cresccm nessas condições de acidez e nào exigem o f~llor dc crescimcn lO prcsen te no suco ele 
tomatc (um glico-d erivCit jvo do <íc ido palllo lê nico). Oenococcus também é res iste llle ao álcool e 
cresce em mc ios conte ndo 10% dc etanol. 
Métodos de análise 
As orien tações abaixo são d a American Public I-Icalth Assoc iation (AP HA), descritas na 4 íl 
Edição do Com/Jendiltlf/, of Mel/tods for lhe Mirrobiological Ewuninalion of Foods (Downes & Ito, 2001) e 
na 17 il Edição d o Standard Metltodsfor lhe Examinalion ofDaú)' PlVdllCls (Wch r & Frank, 2004). 
A contagem d e bac té rias híc ti cas aprcselllad a nesse cap íllllo obj c uva qualllificar tod as as 
bactérias do grupo, sem diferenciação entre os gêneros. Os meios de cultura uti lizados são cspecial-
mente formulad os para garalllir o crescimemo das espécies mais exigentes. A incubação no rmal-
mente é fei ta em cond ições microaerófi las, para recu perar as espécies mais sensíveis ao oxigénio. 
Para a contagem lOtai d e bactérias hícticas cm p rod lllos lácteos, fermell lados ou não, O 
Capítu lo 8 do Standard Me/llods for lhe EWlIllinalioll of Dali)' Protlllcls (Frank & Youscf, 2004) reco-
menda, o plaqueame nto c m profundidade, uLilizando o Ágar de Man Rogosa & Sha rpe (MRS) 
ou o Ágar Elliker como meios de cul tivo. A incubação a 32u C/48h é indicada para a contagem de 
mesófil os e a 37"C/48h pa ra a cOlllage lll de tei'lnodllri cos. Para ga rantir condições microaerófi las 
pode se r usada sobrecamada do mesmo meio o u jarros com a tmosfera m icroaerófila . 
Para a con tagem em o ut ros p rodutos, há recom endações cm vá r ios capítu los do 
ÚJmpem!i1lIll, incluindo o Capítu lo 19 ( I-I a ll el al, 2001), o Capíllllo 47 (Richlcr & Vedam u th u, 
20(1), o Capítulo 53 (Smi tlle & Cili gliano, 200 1), o Capíllllo 58 (Hatchc r el aI., 200 1) e o Capítulo 63 
(Murano & Hudnall , 200 I). 
Dois métod os podem ser usados, O plaq ueame nto e m profu ndidade o u a técn ica do NlI-
mero Mais Prov:.ive l (NMP), com uma série de opções d e me ios de cultura. Esses mcios, suas 
principais aplicações, mé todo d e utili zação e cond içõcs d e incubação e ncon tram-se sumariados 
no Quadro 14.2 e d escritas abaixo. 
a) Ágar/ Ca1do MRS. O MRS (de Man Rogosa & Sharpe) é u m meio desenvolvido para favorece r 
ocrescimento d e vá rios lactobacilos, paniculan nelllc os do leite. Per mite também UIll cresc imen-
10 luxurioso d e Leucol/osloc e PediococclI.s (Richtcr & Vedalllu th u, 200 I). O caldo é recome ndado 
para a contagem d e bactérias I<ícticas heterofermen tativas pelo método do NMP, em d ife rentes 
produtos ( I-I a ll el aI., 200 1) . O ,igar é u m dos meios mais usados para a con tagem e m p lacas, 
podendo se r ac idifi cado c / o u supleme n tado com v;:í ri os co m po nentes, para confer ir u ma certa 
selctividade e/ o ll especificid ade . 
a.I) Ágar MRS 0,5% Frutose. A ad ição de 0,5% de frmose ao !VI RS, incubado a 20-28°C, favo-
rece o c rescimen to de Laclobaccillls jrllc/iuorllnse Ladobaâlllls brevisdc te rioran tes de mai-
o nese e outros molhos para sa ladas. A su plemcn laçào é fe ita adic io nando-se 5m l de 
uma solução aq uosa 10% de frut ose (es terilizada por fil tração ) a 100m I do ágar MRS 
esté ril , fun dido C resfriado (Smittlc & Cirigliano, 200 I). 
a.2) Ágar MRS Acidificado. A ac idi ficaç<.lo do MRS é fe ita para inibir bactérias esporogênicas. 
Usado no plaqucame llto em profu nd idade, tem-se mostrado útil na e numeração de 
bacté ri as I<íct icas d e teriorantes to ta is cm produ l.Os vegeta is. A acid ificação é fc ila adic io-
nado-se ,icid o acé tico glacial esté ril ao • .\gar MRSjá esterilizado, fundido c rcs friado, até 
que o p I-! chegue a5A±0,2 ( I-I a ll et ai .. 2001 , i'v' u rano & I-Iudna ll , 2001). 
211 
~ 1 . 11lI1 .1 1 d~ ~1~ tudos d~ ,\ u;ilb~ i\ licn ,b iulôgic:, d~ Ali'II~,'I.... ~ 1\J.; ua 
Q uadro 14.2. ~I e ios de cultura para cuntagem d e bactérias 1;Í( licas em alillle ll lO~ . sua~ prin cipais aplicações c rorma 
de IIti lil.:lçüo, 
~lc io' l\pl icaç:'lo Múodo' C:ondiç:io de illcubaç:io 
, I~ff. "' i\IRS olI \.olllag"1l1 ro r:i! d.' h:lCrêri:.s l:; c lic :. ~ c ril 1'!a(j1lc:llIlclllo clll :J2t I ue/ '18t311 
"Ifoll' ElIi);~r IHolllll. ,s I:iclcos 11n .r.'l1Ilic!:u!c ~ ~"br~GIIII : llb (f:l\'orccc IIlcsól11os) 011 
do !II<:~ IIIU mdo :17+ I "C/'18+3h 
(f:l\'o r~c <: Icrrm){lllri clI~) 
:tIIIIO~ f<;l-a normal 
1\ g; II' " 11{$ Contagem 101:,1 d e baclérias I:il- l icas l' lII 1'1:111",,;, ,11( 1110 ( III :IDt l"C/'18t3h 
a li me nlos din~ l'SOs pl'nf'lIIdid:,de e .... b rcc .. m :ld:o "llno,fc l~' normal 
do 1II ~" 11I0 m~io 
" hra l' ~II{$ F:I\'Or~('l' l ' 1,IIClol)(/nllll~ fnlr1i.1/1fIlIIJ ~ I'l:lIple:IIII ( IIIO ~'1Il ~{}-:Uf'(:/ :'I é 14 dia~ 
O':J% FnIlOSl' I. /lrlolxm/llll Im'lIIl d( l c ri 01~lIll cS c m prnfulHlidad<: e sohr~ca ln : llb ;t llllo~f~n, ,turmal 
lI1aion~~c c molhos p:I1~' s;,ladas d .. 1I1l'~ I(I" lII ~ i" 
t\g:11' J\mS ('.olllag"1I1 WI:i! dc bactérias I:ic tica ' ,' 111 l 'I :HI" ~: llll e lll() e lll :I:.t I "C /72+3h 
t\c i{lilkado 1'''' .. 1,ll os \'~getai s p ro flllHlid ad<: allae robios<: 
1\g;11' ~ms F:I \'or<:cc,' I Jlrlolmrillll l f r llClillO/'/l1H ~ 1 'l a' I"~;lI l1e tllO c m :\0+ I "r.;:, dias 
I\cidificado I Julol",rillll I filml/flnllII dCle riOl<lIllC' elll p roflllld id:t{le <: MJbr<:Gtlll :tlla :tlllttJ~ f<:n' lIorm:.1 
I "'c Fl'll tm" prOl II1I." I<:W'I:, i, d .. IlIc~mtl m d o 
Ag;l r ~ 1 1{$ CollmgclIl d ,'I:kliGIS (kl<:riol~I1I1 {~ <:111 1'!a(I" camelllO cm 20t l"C/5 d ias 
0, 1 % !\(id o Sóruico pr()dl' I ()~ d rn<:n .. fcrm~ntados. ill ibimlo profl llul ida(k :,u:tcrohiosc 
!c\cdll1~t~ 
'\hr,W ;\\ RS (',OIll :tg~ 1II {!c I:iclicas dcleriOl~I1Hc~ ,' 111 1'1a11"~: IIIl <: 111O e m 20 t loC / :. di:.., 
0.1 % Cbl<:ÍlI :t p rod lll" S c;il'llCos fenn~ll tados . in ihil ld u p,."fl1lldidad~ alla~ ,.. ,bio~<: 
0.02% ,\ddo Sôrbico 1cl'<:l hm ls c h:lCtcrias GI~tm II l'W, Ii\~ I S 
Ag:U' ~II{S com CUI1I :!g<:1 1I {!c I :ict i c ;l~ de l <:rio l~tII le, {'I II 1' 1;1(1"<:;1 111 <:1110 <:11l :~[Jt l "C/9út4 h 
,oh rcC:II11ada (!c APT lIIulll'" p;II~' ,: II :ldas p nlfll mlidadl'" .. oh r{'GI II I;ul:! :l ll m "f~ ,~, Ilonn:ll 
acid ilica{lo d <: AI 'T acidilicõtd u 
I\gar 1\1'1' Enulllc l~U' I:tClira~ heteror~nnen t:tl Í\~'" 1'!a(IU C;l lllen lO c m 2,-.+ I"r./ 72t3h 
cm pnMhllo .. c:in leos cu rad os c p rop:'gal' p rofundidad e e sohrcGunad .. a flllo~fcnl Ilorlll ;.l 
p,'d ionlco, do 111 <:" 1110 m d o 
1\);;'11' AI'T Sacarose EIl Ilt1tC I~ , r I :í tlica~ dclt;l·im-anle~ d e 1');,{I',<:a mc lllo e m :![J+ I"C/'I8-72h 
BC P prodll l<Js c:l l 11<:0 ', (lcfcre nci:llldo Iil- p n,fumlid:u!c t ' sohn;cal ll:td:l ; 1It1t ,,~fc '~1 n01'11I:11 
O"l ro s h:t(' lérias l,rcscl1' cS do 11lt""1O ltI <: io 
I\!fo lr I\I'T Glicose Emll1l<: I~\ r l:icl icas d~l<:r iOl~Il1 I~S d~ Ih ,IOS 1' l:iq ,I<:;IIIlCIIIO e lll '20+ I "C/ 72+~h 
d o mar prollllHlidade :lll a~ r< lbio!><: 
OS!\ En l llll e l~ lI ' m icrorg;:m isrnos detcriOl~,nte' 1'!:t(I , I<:õt lllc ntu " III ~O+ I °r./'18t3h 
(,do M' lac l ic.I~) d c MICO (k 1 :1t~ltIj;, prllfumlid:t(k e sohrCC:ll lt :t(1:! õtl lllo,f<:n, n01'11I :11 
1'0110 " lIl1~ldo cnngcl:ulo c 01111' .. ' do mc .. m o m d o 
prodllltls (lc ri \~I( ln~ Ik Ia,~ tl ti:l 
C.;,ld n MKS CoIII:!gCItl d e bach:' rias l:icliG" T .;clI 1r;, do NMl' :~:H I "C/,I dias 
h<:t~rtlr<:f11It:n 1:11 i'<ls : l l lI l r.~fc l~1 n o rma l 
~:;tldo Rugosa SL' <: COlltagem tlc b:tCtcrb s I:ícticas <:111 T~:c nica du NMI' Rogos:! 
"g:II' ~IRS Mo d ilic:tdo 1II:11ló tia \'t;gel:1I 4!it l"C / :\" ii dias 
:Illllosf"', l n o rmal 
MRS Modilicallo 
:\0+ 1°<:/ 72+:,h 
:ul:l<:rohiosc 
~IR:, " de ,\ 1.111 Rogo". & 510;" '11<.', ,\1' 1 ,\11 I' .. " .... c TW""II, 1\<:1' _ I'.;. I'" ra d,' Im," ........ e ... ,1. O S.\ "/-::'1' S .. ,.o dc l_ll,mj :, 
Fm Indo;, o' ",éltldn, .I,·''''';I<K.:I' ('I , ltUl~' _' is,,1;ub.< delt' ''' "'I' c,,,,rin n:td,L' I'"r .. nlnraç:;o .It· (~,~"n (+). r .. n na da, célula, (o:oco>, 
11;\'IOII<"e' o .. o:ocoh"o:il,,~) " w<,e (k CIt"r:L"" (-). 
:'\c~~c I'rtK<:di"'c .. 1tI " Co,ldo Rogo", SI. I)od,' . ...: r , .. hsllwido 1'",' I<- il.' <'UI P" '-c'·''''<li lll;'\'' " 10'· ... ''' I'klllc ... .. do 0:0111 0.U5% de 
g!in"e ,. i .. o: .. b, .. lo .• ::IO± I"C ,-:I-" di,,,, 
2 12 
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O"lIaj.!clIl de U;u-I ': rias L.;icticas 
a.3) Ágar MRS Acidificad o 1 % Fnllosc. A ad içào de I % d e rru tosc ao MRS ac idi fi cado, incuba-
d o a 30"C, favorece o crcsci mc lllo de Lartobaccillls jruclivortllls c Laclobacillu.s plantarum 
dClnioranLes de produ tos vegetais. Preparar o meio adicionando IOml de uma soluçáo 
aquosa 10% de [nuose (es lerilizada po r fi ltraçào) a 1 OOml do ágar MRS (es téril , fund ido 
e resfriado) c tícido acéLico glacia l es té ril a té que o p I-( chegue a 5,4±O,2 ( I-I all elal., 2001). 
aA) Ágar MRS 0,1 % Ácido Sórb ico . A adição de 0,1 % de ácido sórb ico ao MRS é fcita para 
in ib ir leveduras. É pa r ticu lallllclllc úti l para a CO IlL:"1gCIll de baClé ,ias h:ícticas detcliora ntes 
cm produLOs cárneos rcnnentados. Para a preparação do me io, <uuslar o pH do MRS 
(estéril , fundido c rcsrriado) em 5,7±0, I, com <Ícido clorídrico 5N. Adic ionar então o 
ácid o sórb ico (d issolvido cm NaO J-l ) , na q uan tidade ncccss,íria para conccn tração final 
0, I % (I-Ia ll el ai. , 200 I, Murano & Hud nall , 2001) . 
a.5) Ágar MRS 0,1 % CisleÍna 0,02% Ácido SÓrbico. Essa modificação objet iva inibir leveduras 
c bac té ri as Gram negativas, na contagem de bacthias bicticas deteriorantcs em produ-
lOS d rneos !e n nentados. Para a p reparaçào d o mc io , suplc menta r o MRS com 0,1% de 
c1o rid raLO d e c istC::Ína (cisl.c ína- I-I CI) e cste rilizar. Ajustar o pH do meio estéri l, fu ndido e 
resrriado cm 5,7±0, I, Com .. kido clorídrico. Adicionar c ntào o ácido sórb ico (dissolvido 
em NaO I-l ) , na q uantidade necess;:íria para conccllU<:lção fi nal 0,02% (Hall el ai., 200 1, 
Mura no & 1-ludnalI , 2001). 
a.6) Ágar MRS com sobrccamada de Ágar APT Acidificado. Essa combi nação de meios é 
partiCtllarmc nlc lí lil para a a quantifi cação de bac térias lác ti cas de teriorantcs de molhos 
para sa ladas. O plaqucamcnto e m profu nd idade permitc lIllla ce rta rccupc ração do 
;'str ess" no Agar MRS, antes da adiçüo da sobrec<lmada. Depois d e adicionada, a 
sobrec<lmada de APT acidificado el imina a interrerência de bacté r ias esporogê nicas, 
rrcqucll t.cmente prcsent.es nesses prod utos. O Ágar APT ac idificado é preparado ad icio-
nando-sc ücido tanárico (so l lição aquosa a 10 %, est.eri lizada a 12 1"C/ 15min) ao Ágar 
APT es téril, rll ndido e resfriado, até q uc O p l-l chegue a 4,0±0, I (Hall el aI. , 2001) . 
b) Ágar APT (All Pu.,)ose Tween ). O rig inalme nte descnvolvido para a conL..:"1gclll d e bac térias 
tácticas em p rodutos GÍ rneos curados. é também lIli lizad o para a propagação d c Pediococcus. Pode 
scrsuplemc n tado com sacarose 0 1.1 g li cose, para conferir lima certa espec ific idadc ao mcio. 
b. l ) Ágar APT BCP 2% Sacarose. A ad ição de 2% d e sacarose ao APT com 0,032g/ l d e BCP 
(púrpu ra d e bromocresol) é Illilizada para en umerar bacté rias lácticas dctc rior<\I1tes d e 
p rod utos c<írncos, d iferenciando de outras baClérias. Prc parar o meio adic ionando 20g 
d e sacarosc e 0,032g dc BCP a um litro dc APT, a m es d a estcrilização (I-I a ll el al., 2001 ) . 
b.2) Ágar APT 1,5% Glicose. A ad ição d e mais 5g/ 1 de gli cose ao AP1~ q uej .. l contém J Ogl l, é 
u til izada para enume ra r bac térias hicticas d e te rioran tes d c pcscados e fru tos do mar. 
Preparar o meio ad icionando 5g d e glicosc a um litro dc APT, antes da este rili zação 
(Hall el ai. , 200 1) . 
c)Ãgar Soro d e Laranja(OSA) . Mcio de enriquecimen to d esenvo lvido especificamentc para o culli-
\'Occnumeraçáo dc microrganismos associados com a d e te rio ração d e produ LOs d erivad os de rnltas 
cítricas, permite ó ti mo crescimento de Lacloúacillllse O lllros microrganismos acidúricos. É particu-
2 13 
lannc nLe indicado para a contagem LOlal de microrganismos acróbios em suco de lara rtia concen· 
u-ado congelado c o utros produtos clcliv"ados de Ima nja, incubação ii 30"C/ 48h (Halcher el,al., 2001). 
d ) Ágar/ Caldo Rogosa SL/ Ágar MRS Modificado. Rogosa SL é um me io com características sele-
livas (p l-l 5 ,4 c a lta concclllração de ace tato). desenvolvido pa ra o cultivo de Lactobacilllls de o ri-
gem o ra l c tCca l. Suplclllc lllado com 0,04% de ciclocximida é indicado para a contagem de bacté-
rias hicti cas dete riorantes de matéria vege tal , pela técnica do NM P. Para o plaqucamenLO é lllil iz.l-
do o Ágar M RS Modifi cado, preparado adicio na ndo-se 0 ,0 I % de TTC (cloreto de 2,3,5-
trifc nil lc lrazólium) ao Ága r MRS. Nesse proced imento o Caldo Rogosa pode ser subslilllído por 
Ic itc em pó rcconslimído a 10%, suplemclllado com 0,05% de glicosc c cstcri li zado a 108°C/ 
IOmin (I-Iall el 0[., 200 1). 
14.2. MÉTODO DE CONTAGEM EM PLACAS 
rvlcloclologia da Amcrican Publ ic I-I calth Association (APl-LA) , dcscrita no Capílulo 19 da 4~ 
Edição do Com/JI'IUIiIlIll ofMellw(úIor lhe IHicrobio[QgicolEwlIllinolion oJFoor/s ( I-Iall el, 01.,200 I) c no Capí-
tulo 8 da 17u Edição do Slanrlard Mellwds for lhe EWllllinalion ofDai,)' P/'rxl/l(IS (Frank & Yousef, 2004). 
Am cs dc inic iar as a lividadcs, ler atcntamentc as o ri cntações do C'1pílll lo 3, que aprcscnta 
LOdos os dc talhes c cuidados ell\'olvidos na contagem de mic rorganismos em placas, da seleção 
das diluições ao Gi.lculo dos resultados. ° procedimento descrito aba ixo não apresenta esses dcta-
lhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo analista. 
Atenção. Recome nda-se que a mostras destinadas Li en ullleração de b;:lc térias láclicas não 
scjam congeladas, cm runção da alta sensibilidade desses micro rganismos às injúrias pelo conge-
lamemo. Se o produ to é normalmente congelado, não deve ser descongelado e reconge1ado 
a ntes das amíl ises. 
14.2.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE 
Preparacão da amostra c diluições seriadas 
• Dilue nte: Agua PepLOnada 0, 1 % (H:?Op) e I.ubos de diluiç,\o com 9111 1 de Agua Pepl.onada 
0. 1% ( l-ip p) 
• Pipctas de 1 ou 2ml 
O bservaçáo: consultar o Ancxo 2.2 do Capít.ulo 2 para vnifica r casos especiais c m quc o !..ipo 
ou volume de d iluente va riam em runçáo da amostra ana lisada. 
Contagem cm placas 
• Me io(s) de cllilura: selecionar de acordo com as o rientações do Quadro 14.2 
• Sistema de gcração de atmosrcra anaeróbia ali microaeró fi la (sc recomendado no Qua-
d ro 14.2) 
• Est.ura incubadora regulada na tempcraUlra recomcndada no Q uadro 14.2, com tc rlllc). 
melro cali brado 
Confirmação 
• Reagentes para coloração de Gram 
• Reagente pa ra leste de catalase 
2 14 
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COlltagt;1ll dI; I.\artêrias J..õ1t;ticas 
2. 2. PROCEDIMENTO 
O procedimento d e análise de bacté rias láClicas pelo méLOdo de contagem em p lacas en-
conu'a-sc c1cscriLO na Figura 14.1. 
a) Preparação da amostra e diluições se riadas . Segu ir os' procedimentos descritos no Capítulo 2. 
Entretanto, não deve ser ulili zado Tampüo Fosfato na p reparação das amostras, porque pode 
causa r injúrias às cé lulas . O d il ue n te recome ndado é a Água PcpLOnada O, I % . 
~ 
Nota a.l) Na homoge ne ização de amostras para contage m d e fcnnc nlOS 1.ictcos c m 
produtos fermentados, pode se r va n tajoso utilizaI' liquidificador, para rom pe r cad e ias de 
bac té ri as [jetic<ls. Isso é panic ularmc11Ic útil para p rodu tos recente mente rabri cados, 
pode ndo resultar e m contage n s mai s a c u radas das bac té rias presentcs. O copo d o 
liquidifi cador c o dilu e nt c d C\'Clll sc r rcsfriados antes da homoge ne iza ção. 
Homogeneização 
• ôlO ' 'mi ~ 10 ' • 9ml 
H,Op 
~ lO" 'mi 
• 9ml 
H,Op 
259 de amostra + 
225ml de Agua 
PeplOrlada (H,Op) 
'mi I,ml I,m, 
o 
I 
o 
PlaqueamerllO em profurldidade 
uWizando meio de cullura mais adequado 
(Vide Quadro 14 .2) 
Incubação 
(Vide Quadro 14.2) 
o 
I 
COLARAÇAo DE GRAM I I 
(cocos ou bastonetes Gram +) TESTE DE CATALASE (-) 
I I 
I I CONTAGEM DE BACTÊRIAS LÁCTtCAS I 
UFC/g 
!' ib'\l ra 14. 1. ES(IIlCIlJa dc ar1õÍlisc dc hartl:rias l;ict icas pelo rrll:todo dc corllag-cm cm p];IGIS 
( Hall ri ai .. 200 I . Frank.& YOlIsd. 20fl<l ) . 
b) Inoculação. Selccio nar Il'ês d iluições adequadas e inocular I mI de cada diluição em placas de Pell'i 
estéreis vazias, adicionando, c m sq,'1.lida, o meio de cultura mais adequado ii amostJ,l analisada. Para a 
sclcçào do meio, seguir a OIientaç<i.o do Quadro 14 .2. Na<; siLUações em que seja recomendada a uliliza-
çiode sobrecamada, aguardar a completa solidificação do ;:igar e adicionar Ulll pequena quanlidade do 
meio recomendado para a sobrecamada, coblindo totalmente a superfície do meio inoculado, 
c) blcubação. Incubar as placas invenidas , nas condições estabelecidas no Quadro 14.2. Placas com 
sobrecamada podem ser incubadas em allllosfera normal. Placas sem sobrecamada devem ser acondi-
2 15 
,\lal1\lal {!c ,\ lélOdos de ,\ll!ilise ,\ 1 icrohiolúgicõl (!c Alimel1lOs e ,\gll!1 
cio nadas emjarro com a tmosfera anaerób ia ou m icroae rófi la, conforme a recomendação do Qua-
dro 14.2. Para obte nção da atmosfera anaeróbia , podem ser utili zados sistemas ge radores de 
anae robiose di spo n íveis comercialmeme, C0l110 o BD Biosciences GasPak® Anaerobic Systcms, o 
Anaerogen Oxoid , oAnaerocult A Merck e o Anaerobac Probac do Brasil. Para a geração da atlnos-
fera microacrófila também podem ser utili zados sistemas di spo níve is comercia lme m e, como o 
Anaerocult C jvle rck e o rvlicroaerobac Pro bac do Brasil. Uma o utra forma de o bter a atlllosfe ra 
microaerófi la é ace nder uma vela no j arro, imed iatamcm e ames d e fechar. Depois que a vcla apa-
gar, a aunosfera o btida é adequada para o crescimen lü das bac té ri as lácti cas (Richter & Vedamuthu, 
2001 ). 
d) Confirmação das colônias e cálculo dos resultados. Selccionar pa ra a contagem as placas com 
25 a 250 colônias e com ar I.Odas. Sclccionar pelo menos cinco colô nias p rcsentes nas placas e 
subme ter à coloração de Gram e teste de cata lase. As cullllras Gram positivas (cocos ou bastone tes) 
catalase ncgativas são consideradas confi rmadas como bacté rias lác ti cas. Calcular o número de 
UFC/ g o u m i e m função do número de colônias confirmadas e dilu ição inoculada. Exemplo. 
Plaqueame mo e m profu ndidade, d il uição 10':!, 25 colô nias presellles, cinco subme tidas à confi r-
mação, quatro confirmadas (80 %) . UFC/ g o u mI = 25x I 0~xO ,8 = 2,Oxl Oj. 
14.3. MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) 
Metodologia da Am e rican Public Heal th Assoc iation (APl-IA), descrita no Cap ítu lo 19 da 
4" Edição do ComjJen.diwll of l\tJd/wds for lhe M icrobiological Examinalion of Foods ( Hall el aL, 200 I) . 
Há dois procedimclllos recome ndados, UIll utili zando o Caldo MRS, para bac térias lác ticas 
he te ro fen nenl.ativas, e o utro Ulili zando o Caldo Rogosa SL, para bactérias hícticas to tais. Antes de 
iniciar as atividades, ler atentamente as o rientações do Capítulo 4, que ap resenl.a lodos os d eta-
lhes e cuidados envolvidos na contagem de microrganismos pelo NMP, da se leção das d iluições ao 
cálculo dos rcsultados. ° proccdimento descrito aba ixo não aprescnta esses d e ta lh es, pressupon-
do que sejam conhecidos pelo ana li sta . 
Atenção: Amostras destinadas à enumeração de bac té ri as lác ticas não devem ser congela-
das, emfunção da a lta sensibilidade desses microrganismos às inj úrias pelo congelamento . Se o 
produto é normalme nte congelado, não deve se r desco ngelado e recongelad o antes das anál ises. 
14.3.1. MATERIAL REQUERIDO PARAAANÁLISE 
Preparacão da runostra c diluições se riadas 
• Diluc llle : Água Peptonada 0,1 % (H"Op) 
• Tubos de diluição com 9ml d c Água-Peptonada 0,1 % (H.,Op) 
• Pipe tas dc 1 o u 2m l 
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capítulo 2 para veriricar casos especiai s em que o tipo 
ou vo lume dc dilue nte va riam em função da amostra anali sada. 
Contagem utilizando o Caldo MRS 
• Caldo MRS 
• Estufa incubado ra regulada a 35± I"C com l.crmômetro calibrado 
Contagem utilizando o Caldo Rogosa SL 
• Caldo Rogosa SL 
216 
) 
C.Olll:lgCIll Ik II:lClêri :L'i Lic1i("a~ 
• Ágar MRS Modificado 
• Sistema d e geração de <lullosfera anae róbia 
• Estufa incubadora regulada45±1"Ccom tennômctro calibrado 
• ESlufa incubadora regu lada 30±1"C com lcnnômc t.ro calibrado 
Confirmação 
• Corantes para co loração de Gram 
• Reagente para teste de cata lasc 
14.3.2. PROCEDIMENTO UTILIZANDO O CALDO MRS 
O procedime nto de aná lise de bac térias hícticas hete ro[crmentativas pe lo método elo N~'I'IP 
utilizando o Caldo MRS c nCOlllra·sc descrito na Figu ra -14.2. 
~ Homog,meizaç;1o • 
259 de amostra + 
225ml de Agua 
Peplonada (H,Cp) 
~'" ___ lml • ~ ,,' 'm' ---~ . 9m' H,Op ~ ,,~ 9m' H,Op 
~~~ 
lml lml lml lml l ml lml lml lml lml 
~~~ ~~~ ~~~ 
Caldo MRS (lOml) 
cJ lubo de Ourhan 
Caldo MRS (10ml) 
c/lubo de Ouman 
35:t1 ' C14 dias 
I 
~ To"", wm crescimento e gás 
Caldo de Man, RogoS<! e 
Sharpc (MRS) 
(10ml) c/ lubo de Duman 
COLARAçAO DE GRAM 
(cocos ou bastonetes Gram +) TESTE DE CATALASE (-) 
Tubos confirmados 
I 
CONTAGEM DE BACTERIAS 
LÁCTlCAS HETEROFERMENTATlVAS 
NMP/g 
Fi!lllnl 14.2. Esq Ilema de an:ilis<.: (1..; b:lClêri as hic licas Ile lcrofcrmclltati,'as pelo Inétodo do N,\ 1 P ulili,alldo o C.11(lo 1\1 RS 
(Hallt'/III .. 2001 ). 
217 
,\[a11u:11 (!c i\ lé lud os de A n:i1isc Microbio lógica de 1\limell1us c Agu:, 
a) Preparação da amoslra e diluições seriadas. Segu ir os procedime ntos descri tos no CapíLUlo 2. 
Enlretanto, não d eve se r uti lizado Tampáo Fosf~110 na preparação das amostras, porque pode 
causar injúrias às células . O dilue nte reco me ndado é a Água PcpLOnada O, [%. 
b) Inoculação e incubação. Selccio nar três diluições adequadas da amostra e inocular lima série 
de três LUbos de Caldo rvlRS por diluição , acli cionanclo lm l da diluição po r LUbo com 10ml de MRS 
com tubos de Durhan. Incubar os tubos a 35± I'1C/ 4 dias. 
c) ConfIrmação. Verifica r os tubos com crcscimc l1lo c produção d e g<is, indicativos d e baClérias 
léicti cas hete rorennenta ti vas, c submete r à co loração de Gram e teste de catalase. As culturas 
Gra m positivas (cocos ou basLOn etes) calalase nega tivas são consideradas confirmadas. 
d ) Cálculo dos resultados. Anolar o número de LUbos confirmados e dele nninar o NMP / g ou mi 
conforme a orientação do Capítulo 4, usando uma das tabelas de NMP. 
14.3.3. PROCEDIMENTO UTILIZANDO O CALDO ROGOSA SL 
O procedimenLO de a n<Íli se de bactérias hicticas pelo méLOdo do NMP utili zando o Caldo 
Rogosa Sr.. e nCOlllra-se descri LO na Figura 14.3. 
a) Pre paração da amostra e diluições seriadas. Seguir os procedimen tos descri LOs no Capítulo 2. 
Entreta n LO, nào deve ser utili zado Tampão Fosfato na preparação das amostras, po rque pode 
causar iruúrias às células. O di luente recomendado é a Água Pe ptonada 0,1 %. 
b) Inoculação e incubação. Selecionar três diluições adequadas da a mostra e inocular lima série 
de três tubos de Caldo Rogosa SL po r diluição, adicionando 1 mI da diluição por tubo com 10ml de 
Rogosa. Incubar os I.lIbos po r três a cin co dias a 45±1 ºc. O Caldo Rogosa SL pode ser substituído 
po r leite e m pó reconsti tu ído a 10%, sllplemel1l.aclo com 0,05% de glicose. Nesse caso os tubos 
devem ser incubados po r três a cinco dias a 30± ] ºC. 
c) Plaqueamento. De cada tubo com creSci llle11l.0, es triar (es trias de esgotamento) uma alçada da 
cultu ra em placas de Ágar MRS Mod il'i cado e incuba r as placas a 30± 1 !lC/ 72±3h. 
d) Confirmação. Sclccionar duas co lônias isoladas de cada placa e submeter à co loração de Gram 
e les te de calalasc . As culturas Gram positivas (cocos ou bastonetes) catalase negativas sào cOll$i· 
deradas confi rmadas como bactérias lác ticas. 
e) Cálculo dos resultados. rulOlar o número de tubos confirmados e de terminar o NMP / g ou mI 
confo rme a o rientação do Capítulo 4, usando uma das tabelas dê NMP. 
2 18 
, 
e 
e 
S 
lS 
lS 
II 
o 
1. 
e 
e 
e 
o 
>S 
a 
n 
l -
II 
~ Homogeneização • 
25g de amostra .;. 
225ml de Agua 
Peptonada (H,Op) 
Comagcm de l~actê ri;ls l.;i Cli GL~ 
~'O" lml ~ 10" lml ~ 10~ ---. . 9ml 9ml H,Op H,Op 
~ ~ ~ 
lml lml lml lml lml l ml lml Iml lml 
~~~ ~~~ ~~~ 
Caldo Rogosa Sl (10ml) 
..1 
Caldo Rogosa Sl (lOml) Caldo Rogosa SL (10ml) 
45±1'Cf3-5 dias 
I 
~ T"bo com oce"lmeolo 
Estria de esgotamento 
O Ãgar de Man, Rogosa e Sharpe (MRS) Modificado 30±1 ' C/72±3h 
2 colônias isoladas 
I 
COLARAÇÁO DE GRAM TESTE DE CATALASE (-) (cocos ou bastonetes Gram +) 
Tubos confirmados 
CONTAGEM DE BACTt:RIAS LÁCTICAS 
NMP/g 
J 
Figura 14.3 . ES(111Clna dI.: ;1 1l;ili ~c rlt; haç lérias ];iclica~ pelo 111":10rlo <III NlI l l' 1I1ili'<llldo o Caldo Rogos:! SI . (Hall fi ai .. 20(1 ) . 
2 19 
,\lall11~1 II.· ,\ Iéwdus {Ic An;ílisc /IIicrohinl ')g ic~ til' AlinH.:lllu' l' l \gU<l 
14.4. REFERÊNCIAS 
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22 1 
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