RELATORIO MICROBIOLOGIA 1

Prévia do material em texto

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO DE JANEIRO – IFRJ
CAMPUS NILÓPOLIS
 Relatórios das Práticas
Alunos: Gabriela Macello, Juliana Cordeiro, Karine Belo e Maíra Haddad
Disciplina: Microbiologia I
Professor: Edite Santiago
Data de Entrega: 10/02/2017
Nilópolis, 2017
SUMARIO
Autoclavação de vidrarias e Repique de cepas para caldo nutriente	3
Introdução	3
Objetivos	4
Parte Experimental	4
Parte A – A autoclavação das vidrarias	4
Parte B – O repique de cepas para caldo nutriente	5
Conclusões	6
Preparo de meios de cultura	7
Introdução	7
Objetivos	8
Parte experimental	9
Conclusões	9
Analise da Morfologia Colonial e Biodiversidade Microbiana	10
Introdução	10
Objetivos	10
Parte experimental	11
Parte A – Analise da Morfologia Microbiana	11
Parte B – Biodiversidade Microbiana	12
Conclusões	12
Métodos de contagem de crescimento microbiano	13
Introdução	13
Objetivos	15
Parte Experimental	15
Conclusões	16
Plaqueamento de meios seletivos com as cepas	17
Introdução	17
Objetivos	18
Parte Experimental	18
Conclusões	19
 
 
Autoclavação de vidrarias e Repique de cepas para caldo nutriente
Introdução 
Autoclavação
Foram realizados experimentos de acondicionamento e esterilização, utilizando a técnica de autoclavação, ou seja, técnica realizada em autoclaves. A autoclave é um aparelho que utiliza vapor sob pressão e é comumente usada em laboratórios de pesquisas e hospitais para a esterilização de materiais. O processo de autoclavagem consiste em manter o material contaminado em contato com um vapor de água em temperatura elevada, por um período de tempo suficiente para matar todos os microrganismos.
Pipetas, placas de petri e tubos de ensaios passam por esse processo para se tornarem estéreis. Essas vidrarias foram embrulhadas com papel pardo ou jornal, o que permitiu sua devida isolação, e os tubos de ensaio receberam tampos de algodão permitindo assim que o vapor mate os microorganismos sem interferir na solução ou meio de cultivo. 
Inoculação
Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de um determinado número de microrganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação. A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura.
Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer.
Repique: Consiste na transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro.
As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura para outro. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizados alguns procedimentos para evitar qualquer contaminação, denominados técnicas assépticos.
Primeiramente faz-se a desinfecção da área de trabalho e assepsia das mãos (antes e depois de qualquer trabalho). É preciso trabalhar sempre na área de segurança (aproximadamente 20 cm ao redor do bico de Bunsen) (Figura 1). Esterilizar adequadamente todo material antes e depois de seu uso (aquecer da base para a ponta). Flamba-se a boca dos frascos antes e depois das inoculações, evitando contaminação do material a ser analisado.
Figura 1: área de segurança
De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação.
Técnica de semeadura ou repique de bactérias em meio líquido
Técnica de semeadura ou repique de bactérias em meio semi-solido
Técnica de semeadura ou repique de bactérias em meio solido
Objetivos 
Aprender o correto acondicionamento das vidrarias do laboratório, aprender e executar as técnicas de assepsia em laboratório e aprender como transferir microrganismos de um meio para outro.
Parte Experimental 
Parte A – A autoclavação das vidrarias
Placas de Petri – o conjunto (duas placas) é embrulhado com papel em conjunto. A quantidade de placas a serem colocadas juntas vai depender da necessidade do trabalho.
Pipetas - obtura-se as boquilhas com mecha de algodão (1 cm) e em seguida são enroladas uma a uma com papel, marcando sempre a ponta com caneta no papel, alem das devidas identificações. 
Tubos de ensaio e Erlenmeyers - são preparados introduzindo-se um tampão de algodão cardado na boca do recipiente. Esse tampão deve ser feito, enrolando o algodão no sentido da fibra em quantidade suficiente para facilitar o manuseio, isto é, não deve ser nem muito apertado, nem muito frouxo.
Parte B – O repique de cepas para caldo nutriente
Foram utilizadas 5 cepas para inoculação: 
Pseudomonas aeruginosa;
Klebisiella pneumoniae;
Escherichia coli;
Serratia marcescens; 
Staphylococus aureus;
O grupo ficou com a cepa de Pseudomonas aeruginosa e Klebisiella pneumoniae (Figura 2).
Figura 2: cepas utilizadas.
E as inoculações foram feitas nos seguintes meios de cultura sólidos (Figura 3):
Agar Nutriente
Agar Cetrimide
Agar EMB
Agar Manita
Figura 3: meios de cultura sólidos inoculados.
E no meio de cultura líquido (Figura 4):
Caldo nutriente
Figura 4: meios de cultura líquidos inoculados.
A técnica utilizada foi a técnica de esgotamento direto (Figura 5):
Figura 5: técnica de esgotamento direto.
Técnica na qual a primeira região é onde ocorre o máximo de esgotamento de biomassa, tendo espaços bem pequenos, e a última região é a mais propícia de se obter colônias isoladas para identificação.
Conclusões
A prática propiciou a aprendizagem da forma de preparar vidrarias para esterilização, assim como uma maior percepção da importância da assepsia. As técnicas de manobra para inoculação também foram mostradas e sua utilização elucidada.
Preparo de meios de cultura
Introdução
Meio de cultura é uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de microrganismos. Esses meios garantem às bactérias as condições necessárias para seu crescimento. 
Como existem vários tipos de bactérias, cada uma com uma necessidade especifica de nutrientes, existem também vários tipos de meios de cultura. Além disso, os diferentes tipos de meio são feitos para atender a diferentes necessidades de pesquisa. 
Os diversos meios existentes podem ser classificados como:
Quanto ao estado físico: 
Assim, os meios líquidos só possuem nutrientes e por isso são mais utilizados para a ativação das culturas. 
Os meios semi-sólidos permitem o contato do microrganismo com diferentes níveis de oxigenação e identificação da sua capacidade de movimentação (motilidade).
Já os meios sólidos possibilitam o isolamento de colônias de bactérias, além de facilitar a identificação de possíveis contaminações nas culturas. 
Quanto a natureza de seus nutrientes:
Quanto a sua finalidade: 
Entre as classificações se destacam os meios seletivos e diferenciais. O meio seletivo tem objetivo de inibir o crescimento de determinados microrganismos favorecendo o crescimento de outros. Os meios diferencias são feitos para apontar as diferenças entre microrganismos muito parecidos.
E possível que um meio seja tanto seletivo quanto diferencial, o que possibilita estudar com bastante precisão um microrganismo desejado. Eles diminuem a probabilidade de contaminação. 
A seguir, são listados os meios que foram utilizados pela turma e suas particularidades: 
- Ágar Cetrimide: meio seletivo para o isolamento e contagem de Pseudomonas aeruginosa em amostras biológicas de origem animal, produtos farmacêuticos e cosméticos.
- Ágar Brilliant Green Bile (verde brilhante): também é conhecido como Caldo Verde Brilhante Lactose e é utilizado para a detecção de coliformes em água, alimentos e produtos lácteos. A Lactose é fonte de carboidrato. Bactérias que fermentam a lactose e produzem gás são detectadas. Inibe as bactérias Gram-positivas e muitas Gram-negativas que não seja em coliformes.
- Ágar Cled Brolacin: é um meio de cultura enriquecido, destinado ao isolamentoe cultivo de diversos microrganismos, recomendado para amostras de urina, fornecendo uma boa diferenciação colonial, com características diagnósticas nítidas. Permite, portanto, a cultura e contagem de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas e leveduras. 
- Ágar Nutriente (caldo + agar): O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite, como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras. O uso mais frequente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente neste Agar. É usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram-positivos.
- Ágar Sabouraud: meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos duriformes e filamentosos. É utilizado para cultivo e crescimento de espécies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados a infecções superficiais. Usado, também, para caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante).
Objetivos
Aprender as técnicas para a preparação dos meios de cultura, os tipos de meios empregados para o isolamento e identificação de microrganismos (bactérias e fungos).
Parte experimental
Os meios de culturas preparados em sala foram divididos entre os grupos. Os meios eram: Ágar Cetrimide, Ágar Brilliant Green Bile (verde brilhante), Ágar Cled Brolacin, Ágar Nutriente (caldo + agar) e Ágar Sabouraud.
O grupo ficou responsabilizado de preparar Agar Nutriente, Agar Verde Brilhante e Caldo nutritivo.
Foi calculada a quantidade necessária de cada nutriente para o uso da turma, cada placa com quantidade de 15ml a 20ml e duas placas para cada aluno. Cada reagente foi pesado separadamente diretamente em um erlenmeyer utilizando-se espátulas. Após pesagem, foi adicionado aos erlenmeyers certa quantidade de água destilada, sendo agitado com bastão de vidro ate que todo reagente fosse dissolvido. Após fechar todos os frascos, estes foram identificados (Figura 6) e levados a autoclave por 15 min a 121°C.
Figura 6: frascos com os meios de cultura antes de ir para autoclave.
Após o meio de cultura passar pela autoclave foi vertido para as placas de petri estéreis em manobra asséptica (manipulado dentro da zona de segurança do bico de bunsen).
Conclusões
Através do preparo de cada meio foi possível compreender que cada um tem sua importância na identificação microbiana.
Analise da Morfologia Colonial e Biodiversidade Microbiana
Introdução
Para fazer a identificação das bactérias são consideradas as características morfológicas da colônia (Figura 7). Na prática observa-se: 
O tamanho – em P, M e G.
O pigmento
O odor
A borda
A superfície – podendo ser rugosa, lisa, convexa, côncava, plana ou umbilicada.
O aspecto – podendo ser algodonosa ou mucoide.
A forma – podendo ser arredondada, lobulada ou rizoide.
Figura 7: morfologia vegetal
As bactérias estão presentes em todos os ambientes. Muitas vezes, sua presença não é prejudicial, como os microrganismos que colonizam a nossa pele. Algumas vezes a presença é até benéfica, como na utilização de microrganismos na indústria de alimentos como fermentados ou outras bebidas diversas. 
Objetivos
Identificar os diferentes tipos morfológicos das bactérias e constatar a presença de bactérias no meio ambiente.
Parte experimental
Parte A – Analise da Morfologia Microbiana
Foi feita uma placa para verificarem-se as bactérias no meio ambiente, assim, uma placa de petri contendo PCAe outra contendo PDA foram expostas ao ambiente, no Centro Acadêmico do IFRJ, por cerca de 20 min. Após esse tempo, a placa foi tampada e incubada a 36°C por 48h e a outra a 28° C por 3 dias.
Foram feitas placas para análise da mão, a aliança e unha. 
Para análise da mão foi utilizada uma placa de petri contendo AN que foi dividida em quatro partes (Figura 8), sendo nominadas como: D.S (dedo sujo), D.SAB (dedo com sabão), D.ALC.70 (dedo com álcool 70%) e D.IOD (dedo com álcool iodado). O dedo foi esfregado na placa num estiramento direto. Após esses passos, a placa foi incubada a 36°C por 48h.
Figura 8: divisão da placa
Houve crescimento de colônias nas partes que representam o dedo sujo e após a lavagem com sabão. Era esperado uma diminuição das colônias após o procedimento de lavagem. Isso sugere que o sabão pode estar contaminado. O álcool 70 e iodo mostraram eficácia na assepsia, pois não houve crescimento de microrganismos logo após a utilização desses produtos. O iodo se demonstrou a melhor opção.
Para análise da aliança e da unha, foram feitos os mesmos procedimentos. Foram utilizadas placas contendo PDA e PCA que foram divididas em três. Com o auxilio de um swab, foi limpa a parte de baixo da unha e a parte de dentro da aliança, e então por meio de esgotamento em estria este swab foi esfregado na placa. Após esses passos, as placas foram incubadas a 36º C (PCA) e 28º C (PDA).
Parte B – Biodiversidade Microbiana
Após o crescimento das colônias, sua morfologia foi observada e classificada quanto à forma, borda, superfície, elevação e comportamento frente a luz.
Tanto as placas correspondentes a aliança e a mão de um dos componentes do grupo não tiveram crescimento considerável e nem uma diversidade microbiológica grande. Já as placas que estavam no centro acadêmico (Figura 9) tiveram resultado bem interessante:
Figura 9: placas com o ar do centro acadêmico
Houve um crescimento considerável de bolor na placa PDA. Já na placa PCA obteve-se crescimento e diversidade de colônias. Elas foram classificadas como: lisas, opacas, convexas, circulares, lobuladas. Colônias rizoides e planas também estavam presentes.
Conclusões
A prática foi importante para mostrar a diversidade de microrganismos presente em diversos meios habitados pelos estudantes e em seus próprios corpos. Foi observado também que é necessário pouco tempo de exposição da placa em um ambiente para que os microrganismos se desenvolvam nelas. Os meios e temperatura de armazenamento também têm papel fundamental, pois podem favorecer o crescimento de uma colônia em detrimento de outra.
Métodos de contagem de crescimento microbiano
Introdução 
Quando uma cultura microbiana se desenvolve em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva que é subdivida em: fase lag, log, exponencial e declínio.
Fase lag:
Fase em que se tem um período variável, onde não há aumento significativo da população (tem-se pouca ou ausência de divisão celular), porém é a fase onde são sintetizadas diversas enzimas e moléculas variadas, tendo um aumento na quantidade de proteínas, peso seco e tamanho celular.
Fase log:
Fase onde as células estão plenamente adaptadas, causando um crescimento exponencial das células, que muitas das vezes são influenciados pelas condições de cultivo.
Fase estacionária: 
Fase da qual não há um crescimento líquido da população , pois o número de células que se dividem é equivalente ao número de células que morrem, devido à escassez de nutrientes e ao aumento de produtos tóxicos. Algumas bactérias nessa fase sintetizam esporos (esporulação) para tentar sobreviver. Temos também alteração do fenótipo por “quorum sensing”.
Fase declínio:
Nessa fase a maioria das células estão em processo de morte. A contagem total permanece constante enquanto que as viáveis caem lentamente. Em alguns casos temos a lise celular.
Existem diversos métodos de determinação de biomassa microbiana. Elas podem ser feitas através do peso seco, do peso úmido, focando algum constituinte celular como por exemplo as proteínas e a contagem de células. Este último é o mais utilizado em microbiologia e pode ser realizada uma contagem direta ou indireta.
Métodos diretos: uma contagem real do número de células é realizada. Elas podem ser feitas através da câmara de Neubauer, epifluorescência ou contador de partículas, por exemplo.
Métodos indiretos: a contagem celular é feita por estimativa. Esse tipo de contagem pode ser feito por turbidimetriae contagem em placa de células viáveis, por exemplo.
A contagem em placa tem como vantagem quantificar apenas as células viáveis e apresenta a desvantagem de um tempo de incubação longo, em geral 24, para o aparecimento das colônias visíveis em placa. Esse tempo pode impedir o uso dessa técnica em áreas como controle da qualidade do leite pois não é possível manter o lote por um período longo. Esse método considera que cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma bactéria. Isso nem sempre é verdade, uma vez que as bactérias frequentemente crescem em cadeias ou em grumos. Para refletir essa realidade, as contagens em placas são feias nas chamadas unidades formadoras de colônias (UFC).
Para realizar esse método, é essencial que somente um número limitado de colônias cresça em cada placa. Quando muitas colônias estão presentes, ocorre saturação impedindo o crescimento de algumas colônias e dificultando a contagem. Pela convenção do Food and Drug Administration, órgão norte-americano que controla alimentos e medicamentos, deve-se realizar a contagem em placas que contenham de 25 a 250 colônias, mas microbiologistas preferem de 30 a 300 colônias.
Quando essa metodologia é empregada, deve-se fazer diluições seriadas para garantir que o número de colônias na placa permaneça na faixa desejada. Existem duas técnicas que empregam essa diluição: espalhamento em superfície (spread-plate) e plaqueamento em profundidade (pour-plate).
A primeira técnica consiste em sucessivas diluições da amostra, e que em cada diluição é espalhada em duas placas de Petri contendo meio de cultura 0,1 ml da amostra. Após o plaqueamento e incubação, por tempo e temperatura adequados, as células ou pequenos agrupamentos vão crescer isoladamente, dando origem a colônias que serão contadas na diluição apropriada e, portanto, chamadas de unidades formadoras de colônia (UFC). O ideal é entre 30 e 300 colônias. Os tubos muito diluídos não terão células suficientes, ao mesmo tempo em que os tubos muito concentrados terão excesso de células, e assim sendo não será possível se fazer uma contagem adequada nas respectivas placas. Após os cálculos adequados, levando-se em conta diluição e volume, é possível determinar a quantidade de microrganismos presentes em determinado peso ou volume do material inicial. O crescimento se dá na superfície do meio.
A segunda técnica tem como meio de cultura o ágar fundido que permite o crescimento não só ao longo da superfície como no interior do ágar. É adicionado 1,0 ml das amostras diluídas no fundo de uma placa estéril e em seguida adicionado o ágar, ainda líquido, mantido a cerca de 40 a 45°C. A homogeneização do inoculo é feita com movimentos suaves em forma de “8” sobre a bancada. É preciso garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização nem fique muito quente para não matar as células microbianas. O crescimento se dá na superfície e no interior do meio de cultivo.
Objetivos 
Determinar o número de microrganismos presentes na suspensão através dos métodos de contagem em placa.
Parte Experimental 
Foram feitas as diluições dos meios líquidos e utilizou-se as diluições de 10-4 até 10-7. Para o spread plate, foi colocado 0,1 mL de cada diluição, da mais diluída para a menos diluída, nas placas em duplicata. Foi realizado um estriamento sinuoso com a alça em todos eles.
Observe os resultados após incubação:
Figura 10: placas com crescimento de colônia após incubação no método spreade plate.
A diluição 10-4 originou colônias de coloração vermelha e poucas de coloração amarela. Já nas outras diluições as colônias amarelas predominaram. Possivelmente o meio líquido que originou as diluições estava com mais deu tipo de microrganismo.
As colônias vermelhas, ou seja, placas com diluição de 10-4 foram escolhidas para contagem. Porém, observou-se que o valor ultrapassaria 300 UFC durante a contagem. Portanto, a contagem não foi finalizada. Caso tivesse sido, a conta a ser realizada seria:
Conclusões 
A prática propiciou conhecimentos acerca dos diferentes métodos de contagem e de sua importância. Além disso, mostrou aos estudantes como realizar as técnicas de contagem por plaqueamento.
Plaqueamento de meios seletivos com as cepas
Introdução 
Meios seletivos permitem o crescimento de certos tipos de microrganismos e inibem o crescimento de outros microrganismos. Eles contêm inibidores, geralmente antibióticos, que tornam inviável o crescimento de certos microrganismos, sem inibir o crescimento do microrganismo-alvo. Alguns deles:
Ágar eosina azul de metileno (EMB) O EMB contém corantes de eosina e azul de metileno que inibem as bactérias gram-positivas num determinado grau, o que o caracteriza como meio seletivo. Os corantes funcionam também como indicadores de diferenciação em resposta à fermentação da lactose e/ou sacarose por microrganismos.
Os coliformes produzem colónias pretas-azuladas, enquanto as colônias de Salmonella e Shigella são incolores ou têm uma cor âmbar transparente. As colônias de Escherichia coli apresentam um reflexo verde metalizado característico, devido à rápida fermentação da lactose.
Ágar manitol sal Ágar Sal manitol é um meio de cultura, muito usado para o isolamento de Staphylococcus aureus de amostras biológicas como urina, secreções e feridas. Também usado na indústria alimentícia para o isolamento e identificação de estafilococos em líquidos e produtos lácteos, carnes e derivados, incluindo conservas e pescados.A degradação do manitol com a produção de ácido muda a cor do meio de rosado a amarelo. Devido ao seu alto conteúdo de cloreto de sódio, pode-se fazer uma inoculação maciça da amostra em estudo. As colônias de Staphylococcus aureus fermentadores do manitol são grandes e rodeadas de uma zona amarela.
Ágar cetrimide É seletivo e diferencial para espécies de Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria gram-negativa. Sua coloração é âmbar claro e na presença da bactéria torna-se azul ou azul-esverdeado. É muito usado no controle de cosméticos, produtos farmacêuticos e material médico para testar a presença de Pseudomonas aeruginosa cuja presença não é permitida nestes produtos.
A cetrimida (brometo de cetiltrimetilamônio) é um composto quaternário de amônio que inibe um grande número de bactérias incluindo espécies de Pseudomonas exceto Pseudomonas aeruginosa. A produção de piocianina (um pigmento azul, não-fluorescente) é estimulada pelo cloreto de magnésio e sulfato de potássio. O meio também favorece a produção de pigmentos fluorescente (pioverdinas) por algumas cepas de Pseudomonas aeruginosa. 
 A maioria das espécies de Pseudomonas aeruginosa podem ser identificadas pelo odor característico, parecido com uva, atribuído pelaa aminoacetofenona.
Objetivos 
Comparar o crescimento ou não de cepas em diferentes meios seletivos.
Parte Experimental 
Foram utilizadas duas cepas gram positivas: Staphyloccocus aureus e Staphloccocus epidermides e duas cepas gram negativas: Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Duas placas de cada meio foram divididas pela metade e em cada metade, cepas com a mesma classificação gram foram inoculadas.
Observe o crescimento em cada meio:
EMB Interpretação:  Fermentadores - verde metálico/azul/preto; não fermentadores - sem cor ou roxo claro. A E. Coli se destacou em relação a P. aeruginosa por ter apresentado um verde metálico chamativo, indicando a fermentação da lactose do meio. A P. aeruginosa teve uma coloração menos expressiva, sugerindo não ser fermentadora. Apenas foi inoculado a placa com bactérias gram-negativas, por erro do grupo.
Manitol: Interpretação: Staphylococcus aureus é amarelo (fermenta o manitol), outros staphylococci são brancos.
No meio manitol, observa-se a coloração amarela e colônias amarelas do crescimento de S. aureus. O crescimento de S. epidermides não apresentou coloração capaz de se destacar no meio. Com as bactérias gram negativas, não houve alteração.
Cetrimide: Como o meio é seletivopara P. aeruginosa, apenas houve mudança na coloração dessa cepa, que se tornou azul esverdiada.
Conclusões 
Foi observado que os meios de cultura seletivos são eficazes e de extrema importância para auxiliar a identificação de determinados microrganismos. Por essa razão são muito utilizados no controle de qualidade de muitas indústrias.
Referencias
Apostila de Aulas Praticas, Bacteriologia. Disponível em: http://www.uff.br/labac/Apostila_Pratica_Nutricao.pdf. Acesso em: 16/02/2017.
Caldo Verde Bile Brilhante. Disponível em: http://foodsafety.neogen.com/pdf/Acumedia_PI/7119_PT_PI.pdf . Acesso em: 21/02/2017.
Debortoli de Carvalho, Luciana. Preparo de Materiais em microbiologia, Meios de cultura usados no laboratório, técnicas de semeadura e Colorações. Disponível em: http://www.ufjf.br/microbiologia/files/2012/11/Meios-de-cultura-usados-no-laborat%C3%B3rio-e-colora%C3%A7%C3%B5es.pdf. Acesso em: 17/02/2017.
Métodos para quantificar o crescimento microbiano. Disponível em: http://vida-microscopica.blogspot.com.br/2012/05/metodos-para-quantificar-o-crescimento.html. Acesso em: 20/02/2017.
Microbiologia de Alimentos. Disponível em: http://eamicrobiologia.blogspot.com.br/2012/01/acompanhamento-da-curva-de-crescimento.html. Acesso em: 20/02/2017.
Relatórios de Microbiologia Básica. Disponível em: http://microbiologia-basica-facimp.blogspot.com.br/2015/09/relatorios-022015.html?m=1. Acesso em: 16/02/2017.
Roteiro de Praticas, Microbiologia Geral. Disponível em: http://www.proac.uff.br/odontonovafriburgo/images/stories/pr%E1ticas%20micro%20geral.pdf. Acesso em: 17/02/2017.
Técnicas de Semeadura. Disponível em: http://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/09/tecnicas-de-semeadura.html. Acesso em: 21/02/2017.