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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAUDE DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA 6. “SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL” Jéssica Das Mercês Neiva Silva – 90818 Paloma Malheiros Lemos Crissafe Dos Santos – 93126 Alicia Beatriz Moreira de Queiroz– 93129 Bianca Horta – 93119 Introdução: Chamados de monopeptídeos, os aminoácidos são moléculas orgânicas formadas por cadeias de carbono, ligadas a átomos de hidrogênio, oxigênio, nitrogênio e, às vezes, enxofre. Contendo um grupo carboxila (COOH) e um grupo amina (NH2). Existem na natureza vinte tipos de aminoácidos, diferidos por um grupamento denominado radical (R), classificados conforme suas propriedades químicas: os que apresentam cadeia polar, outros com cadeia apolar e os que podem adquirir carga elétrica. Os aminoácidos se diferem nos grupos R, que variam em estrutura, tamanho e carga elétrica. Os aminoácidos são classificados em cinco grandes grupos baseados no grupamento R, são eles: grupo R alifáticos, não-polares; grupo R aromático; grupo R não-carregados, polares; grupo R carregado positivamente; grupo R carregado negativamente. A cromatografia em papel é clássica onde uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical. O papel é composto por moléculas extremamente longas chamadas celulose. A celulose é um polímero polar com muitas regiões de altas e baixas densidades de elétrons. A cromatografia em papel é uma das técnicas mais simples e que requerem menos instrumentos para a realização, porém também apresenta as maiores restrições para realização em termos analíticos. Ocorrerá duas fases no processo. Fase estacionária: fase fixa onde a substância que está sendo separada ou identificada fixa-se na superfície de outro material. Por exemplo, um papel de filtro. Fase móvel: nesta fase as substâncias que queremos isolar são “arrastadas” por um solvente fluido, que pode ser líquido ou gasoso. Por exemplo, vapor do álcool Etílico. Os aminoácidos podem ser separados por cromatografia em papel devido à solubilidade que os diferentes tipos dessa substância apresentam pela água de hidratação ao redor das fibras de celulose e pela fase orgânica móvel que flui através dessas fibras. A solubilidade relativa dos aminoácidos nestas duas fases pode ser mudada por alterações na polaridade do solvente, ou no pH da solução, o qual irá alterar o estado iônico dos aminoácidos. Sob um conjunto adequado de condições, então, cada molécula de uma mistura ira se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase estacionária e estará a uma distância específica de um ponto de origem, quando cessar o fluxo de solvente. Este fenômeno pode ser convenientemente expresso como um fator de retardo ou fator de retenção (Rf). Objetivos: Separação e identificação de componentes de uma mistura contendo aminoácidos. Aplicação correta de aminoácidos no papel de filtro. Preparo de um sistema para experimentação da cromatografia em papel de aminoácidos. Revelação de cromatograma. Identificar os aminoácidos no cromatograma pelos seus valores de Rf. Definição de fase móvel e fase estacionária, cromatografia monodirecional , bidirecional e cromatografia ascendente e descendente. Pratica: Materiais: Papel de filtro Whatman n°1, em retângulo de 15 x 20 cm; Tubos capilares; 1 forro de papel; Lápis e régua; Estufa a 90-100°C Cuba cromatográfica com tampa Pulverizador. Reagentes utilizados: 3 soluções de aminoácidos identificados(alanina, ácido aspártico e isoleucina). 1 solução de aminoácido desconhecido. Solvente: mistura de butanol – ácido fórmico - água (100: 30: 25 Revelador: solução de ninidrina 0,1 % em acetona. Procedimento: ABRF= A/BFigura-1 3.2 PROCEDIMENTO 01. Em uma das extremidades da tira de papel de filtro, a uma distância quegaranta não tocar a superfície do solvente, traçar uma transversal comoreferência para o ponto de origem.02. Tocar com a ponta do tubo capilar, contendo a solução do aminoácido omeio da linha de ponto de origem, deixando escoar um pouco da solução, masevitando que se espalhe por uma área de raio maior que 5 mm. Secar.03. Repetir a operação duas vezes, tendo o cuidado de secar a solução antesdo toque seguinte. Os três toques colocarão 5 a 10 μL de uma solução a ser cromatografada.04. Fazer uma dobra na extremidade do papel de filtro contrária àquela ondefoi feita a aplicação da amostra. Fixar a tira de papel na faze interior da rolha decortiça por meio de um percevejo, de modo que a dobra se localize sobre o seudiâmetro.05. Tampar o tubo de ensaio com a rolha fixada à tira de papel filtro, tendo ocuidado de não deixar que a tira permaneça em contato coma parede internado tubo.06. Mergulhar a tira de papel de filtro no solvente +ou- 5 cm, evitando que oponto de aplicação das soluções entre em contato como solvente.07. Esperar o tempo suficiente para a frente do solvente alcançar +ou- 1,5 cmda rolha ou até 10 a15 cm de altura do ponto de origem.08. Retirar a tira de papel de filtro da rolha e tampar novamente tubo.09. Marcar imediatamente a lápis o ponto atingido pela frente do solvente.10. Secar a tira de papel de filtro na estufa a
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